ゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ細胞死のライブ画像

要約

出典: Niu, L. ほか。 ゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ溶解細胞死の生体内顕微鏡による可視化。 J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、 マイコバクテリウム・マリナム 感染後のゼブラフィッシュ胚におけるマクロファージ溶解細胞死を視覚化するためにバイタルバイタル共焦点顕微鏡法を用いる方法を示しています。

プロトコル

1. 感染のライブイメージング

1. 1. ライブイメージングのためのフィッシュマウント
   1. 最大10個のトリカイン麻酔胚をガラス底の35mmディッシュの中央に移植します。余分なE3中程度のカードは捨てましょう。
   2. 1%の低融点アガロースを皿にかけ、10Gの針でゼブラフィッシュ胚を慎重に配置します。ガラスの底皿を氷の上で10秒孵化させてアガロースを固めます。
      注: 中脳注射では、胚をアガロースに装着し、頭部を上向きにします(図1A)。
   3. 完全に固まったら、卵水(さらにトリカイン1xとPTU(N-フェニルチオウレア))をアガロースの上に覆います。
2. 三色高分解能タイムラプス共焦点顕微鏡
   注: 以下の手順は、63.0x 1.40の油外対物レンズを搭載した共焦点顕微鏡で行われます。
   1. 環境チャンバーの温度を28.5°Cに設定します。チャンバー内に湿ったティッシュペーパーを置き、湿度を確保し卵水の蒸発を防ぎます。
   2. 35mmのガラス底皿とゼブラフィッシュを環境チャンバーに入れます。
   3. 共焦点ソフトを開き、ステージを初期化してください。63.0×1.40の油用UV対物鏡に切り替え、明視野チャンネルと差分干渉コントラスト(DIC)フィルターを使ってゼブラフィッシュの位置を特定します。
   4. 405ダイオード、アルゴン(20%出力)、DPSS 561nmレーザーを開けてください。適切なレーザー出力とスペクトル設定を設定してください。
      注: 以下は、セルリアン(励起=405 nm;放出=~456–499 nm)、eGFP(励起=488 nm;放出=~500–550 nm)、DsRed2(励起=561 nm;放出=~575–645 nm)のスペクトル設定です。
   5. 「XYZ」の「シーケンシャルスキャン」取得モードを選択し、画像フォーマットを「512 x 512ピクセル」に設定します。
   6. 「ライブデータモード」に切り替えてください。最初のゼブラフィッシュの位置を狙い、「開始」と「終了」Zの位置をマークします。このプロセスを残った胚すべてで繰り返します。番組の最後に「一時停止」を追加することもできます。
   7. プログラムのループとサイクルを定義します。
   8. ファイルを保存してください。

結果

図1:ライブイメージングのためのゼブラフィッシュ胚のマウント。 (A) 中脳感染の場合、ゼブラフィッシュ胚は頭部を下向きに取り付けました。(B)幹部感染の場合、ゼブラフィッシュ胚はガラス底板皿の底部近くに注射部位を横方向にマウントしました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガラス底の35mm皿	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
アガロース	サンゴン・バイオテック	A60015
共焦点顕微鏡	ライカ	TCS SP5 II
環境室	ペコン	温度制御 37-2 デジタル
マイコバクテリウム・マリナム			ATCC BAA-535
N-フェニルチオウ尿素(PTU)	シグマ	P7629