新生マウス脾臓食細胞による細菌死のin vitro評価

要約

出典: セマン、B. G.、 et.al。グラム陰性細菌敗血症の新生児イメージングモデル。 J. Vis. Exp. (2020年)

この動画は、新生マウス脾臓から好中球と炎症性単核球を分離し、発光細菌殺菌アッセイに応用する方法を示しています。機械的解離、赤血球溶解、磁気ビーズによる細胞濃縮、細菌培養、抗生物質保護を含みます。発光のタイミング測定は、初期の細菌内部化の後に免疫介在による除去を示します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手続きは、適切な動物倫理審査委員会によって審査・承認されています。

1. in vitro細菌殺菌アッセイ

1. 感染していない新生児の子脾臓を取り出し、無菌の60mmペトリ皿内の40μmナイロンバスケットに入れます。これを繰り返し、脾臓を一つの管にまとめて採取し、均質化します。
2. リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を5mLに加え、10%の胎児用牛血清(FBS)を補足します。
3. 無菌の3 mLシリンジプランジャーを使って組織を分解し、単一細胞懸濁液を作り出します。
4. ナイロンバスケットの外側に単一細胞懸濁液を集め、15mLの遠心分離機チューブに移し、350 x g でペレットセルを5分間投与します。
5. 細胞を赤血球溶解バッファー(最大7〜8個の脾臓用2 mL)に懸浮させ、室温で5分間放置して赤血球を除去します。
6. 脾細胞を上記のようにPBSとペレットで洗浄します。
7. 脾細胞を0.25mLのPBSに、0.5%のBSAと2 mM EDTAを補足して、期待される細胞収量に応じて懸浮させます。
8. ヘモサイトメーターや適切な器具を使って脾球数を数えます。
9. 免疫磁気ビーズでLy6B.2⁺ (粒球/炎症性単球の骨髄集団)細胞を分離します。
10. Ly6B.2⁺ 細胞を、1枚×10個の^5個細胞 密度で、黒または白の96ウェルプレートに、10% FBS、2 mM グルタミン、25 mM HEPES(完全培地)を含む0.1 mLのDMEMの容量でシードします。
11. 生物発光性 大腸菌 を列挙し、最終体積0.1 mLで所望の感染多数(MOI)で細菌接種物を準備します。これは、すべての井戸に必要なものを共通MOIでバッチで製造するのが最適です。
12. 対照として細菌接種剤または完全培地を0.1mL追加します。マルチウェルプレートは37°C、_CO25 %で1時間インキュベーションします。
13. ピペットで培地を優しく取り出し、新しいピペットチップで新しい培地を加え、ゲンタミシンを含む0.2mLの新鮮な完全培地(100 μg/mL)に交換します。培養液をさらに2時間の孵化に戻してください。
14. 感染後3時間後、蓋付き培養皿の各ウェルの発光をプレートリーダーで下から測定し、培養液を再び培養に戻します。
15. 他の望ましい時刻点での発光測定を繰り返します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ACK溶解バッファー	ギブコ	LSA1049201	細菌除去アッセイ
アンチLy-6B.2マイクロビーズ	ミルテニ・バイオテック	130-100-781	細胞分離
大腸菌 O1:K1:H7-lux(ルシフェラーゼ発現)	該当なし	該当なし	WVUで自社建設
アイソレーションバッファ	ミルテニ・バイオテック	該当なし	細菌除去アッセイ
LBブロス、レノックス	フィッシャー・バイオリエージェント	BP1427-500	細菌の増殖
EASYstrainer(ナイロンバスケット)	グライナー・バイオワン	542 040	セルストレーナー
スペクトラマックス iD3	分子デバイス	該当なし	プレートリーダー