新生マウスの感染を被覆した発光細菌を用いたモデル化

要約

出典:セマン、B. G.ら グラム陰性細菌敗血症の新生児画像モデル。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、被覆された生物発光細菌を用いて全身感染を研究するための新生マウスモデルを実演しています。新生児の子は高用量または低用量の細菌懸濁液を注射され、産後のケアのために母親の元に戻されます。被包された細菌は早期免疫検出を回避し、全身的に広がり、発光イメージングを用いて時間をかけて可視化されます。このモデルにより、新生マウスの感染進行を非侵襲的に追跡することが可能になります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 細菌接種剤の調製

1. トリプティック大豆寒天(TSA)プレートに接種ループを施し、冷凍庫からルシフェラーゼを安定的に発現しカナマイシン耐性を持つ大 腸 菌O1:K1:H7-lux の単一コロニーを分離します。37°Cで一晩抱卵します。
2. 翌日、ルリアブロス(LB)をバイオセーフティキャビネットで室温(25°C)まで保温します。
3. バイオセーフティキャビネットのフードの下で、ストリークプレートから単一の菌株を特定し、カナマイシン(30 μg/mL)を補足したLB3 mLで接種します。37°Cで一晩培養し、毎分220回転(rpm)で振る。これがスターター文化です。
4. スターター培養を1:100で新たに3 mLのLBに希釈し、バイオセーフティキャビネットのフードの下で37°Cで2〜3時間、振って220 rpmでインキュベーターに戻します。これがストックカルチャーです。
5. 分光光度計を使って600 nmのブランクおよびストック培養の光学密度(OD)を読み取ります。細菌を含まないLBを100μLを96ウェルの平底アッセイプレートの1ウェルに加えます。これは空白です。その後、ストック培養から100μLを別の井戸に加えます。これをさらに2回繰り返します。吸波はプレートリーダーで読み取られます。
6. 株価培養吸収度値(OD値)から空白吸収度を差し引き、以前に生成・検証済みの成長曲線と比較することで、感染用量の準備に用いられる株育て中の細菌密度の近似値を算出します。
7. 研究課題に応じてターゲット接種源を生成します。本研究では、マウス(/マウス)ごとに2×10⁶(低)および7×10⁶(高)コロニー形成単位(CFU)を標的接種しました。
   1. マウスごとの目標投与量(DoseT)をストック培養中の推定細菌濃度(Stock)で割ると、ストックチューブから必要な細菌量(VS)が得られます。
   2. 感染すべきマウス数(NM)と、感染に必要な細菌総量を5〜10匹分のマウスに掛け、さらに5〜10回の追加投与量を掛けます。この容量を純正チューブから取り出し、新しい遠心分離機チューブに追加してください。
   3. 以下の式を用います:DoseT/Stock = VS × NM = ストックチューブから除去される細菌の総体積(VT)。
8. 細菌を2,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、感染対象マウスごとに50μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.2-7.6)に再懸浮させます(例:2個×10⁶菌を10回投与した場合、2個×10⁷菌のペレットは500 μL PBSに再懸濁します)。これも必要以上に接種剤を準備することが推奨されます。対照接種用に同量のPBSを準備してください。感染性接種とPBSコントロールは感染まで氷上保管してください。
9. 96ウェルのプラスチック底希釈プレートでPBSに7回の連続希釈を行い、その希釈量を25μLを重複してカナマイシン(30μg/mL)を補足した象限のTSAプレートにプレートし、実際に投与された細菌量を列挙します。調査前にコロニー形成のために37°Cで一晩抱卵します。

2. 動物の識別

1. 年齢相合した子犬のために、繁殖ペアを十分に揃えて、同胞胎を同期させましょう。年齢変動が1日±許容範囲です。
2. 妊娠中のC57BL/6メスのマウスを特定し、計画された実験に先立ち、出産を監視して正確な年齢を判断します。
3. 対照群と感染した3日または4日齢の子犬を区別するために、細い先端の小さな虹彩ハサミで対照群の子犬の尾の端だけを切り取ります。感染した子は尾のチョキは受けません。尾を切る前に、70%エタノールをたっぷり浸した綿球で皮膚を消毒します。必要に応じて綿球やガーゼで尾の先端に圧力をかけます。
   注: この処置はバイオセーフティキャビネットのフードの下で行われます。尾の約1/8インチの切り方で十分です。
4. 対照群と感染群の子を識別するには、1mLのインスリン注射器と28G×1/2インチの永久針を使って子犬の尾にタトゥーを入れます。タトゥーを入れる前に、70%エタノールをたっぷり浸した綿球で皮膚を消毒してください。この処置はバイオセーフティキャビネットのフードの下で行われます。
5. 尾にタトゥーを入れるには、針の先に動物のタトゥーインクを塗ります。次に、片手で子犬をしっかりと拘束し、尾を完全に露出させます。針を皮膚の下に優しく差し込み、浅い深さを保ちながら、針を皮膚と平行に数ミリ動かして小さな模様(点)を作ります。余分なインクが皮膚から漏れないように、針を皮膚の下からゆっくりと抜く前に数秒待ちます。
6. 必要に応じて綿球やガーゼで傷口に圧力をかけてください。皮膚表面の余分なタトゥーインクは70%エタノールで除去します。
7. このプロセスを感染者と対照群のマウスで繰り返し、連続する子犬ごとに追加の点を加えます(例:子犬1の尾に1点、子2の尾に2つの点がある、など)。
   注: 追加の識別層として、対照群と感染群ごとに動物用タトゥーインクの色を分けて使うことが推奨されます。

3. 肩甲下接種

注: 本研究では、低用量グループと高用量グループをそれぞれに割り当てた2つの実験が実施されました。最初の実験では、7匹の子犬に低用量接種剤(4匹が対照群として使用)が投与され、別の子犬から5匹が高用量投与され(3匹が対照群として使用されました)。実験1の子犬は24時間の時間点のみのデータを提供しました。2回目の実験では、8匹の子に低用量接種(対照群として2匹)、高用量接種剤を6匹(対照群に2匹)を与えました。実験2の子犬は0時間、10時間、24時間のタイムポイントのデータを提供しました。

1. 子犬の年齢は1日目≤合わせます。各子を低用量または高用量の分に分けてください。一窩の子犬の中で、ランダムに子犬を対照か感染した子犬に割り当てます。
2. 出生後3日目または4日目には、大 腸菌 またはPBS対照群で接種前にすべての子犬の体重を記録します。この間、感染中に子犬が動かされないようにダムと子犬を分離してください。
3. バイオセーフティキャビネット内でインスリン針を使ってPBSまたは大 腸菌 接種剤を吸引します。この研究では、マウスごとに2×10⁶および7×10⁶ CFUの接種剤が使用されました。感染性接種とPBSは、肩甲骨下注射による投与まで冷蔵保存してください。
4. ネオネーションをバイオセーフティキャビネットのフード内のきれいな場所に置き、首の後ろの皮膚をまるで子犬の首根の後ろで引っかくように持ち上げます。
5. 皮膚と筋肉の間にできた隙間に針を刺し、皮膚のすぐ下で面取りし、50μLのPBSまたは 大腸菌を注射します。同時に、圧迫された皮膚部分を解放して注射の逆流を防ぎます。
6. 針はゆっくり慎重に外してください。注射が終わったら、子犬はダムを使って戻してください。注: 発達段階の解剖学的段階から、3〜4日目に尾静脈や腹腔内注射を新生児の子に投与するのは技術的に難しいです。したがって、執行が容易なことから、この研究では肩甲下感染経路が選ばれました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL インスリン注射器	コロビデン	1188128012	接種またはPBS注射
動物タトゥーインクペースト	ケッチャム	KI1482039	動物の識別
動物タトゥーインク グリーンペースト	ケッチャム	KI1471039	動物の識別
大腸菌 O1:K1:H7	ATCC	11775
大腸菌 O1:K1:H7-lux(ルシフェラーゼ発現)	該当なし	該当なし	WVUで自社建設
DPBS、1倍	コーニング	21-031-CV
ディフコ・トリプティック大豆寒天	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	236950	細菌の増殖
IVIS Spectrum CTおよびLiving Image 4.5ソフトウェア	パーキン・エルマー	該当なし	生命体内画像診断
LBブロス、レノックス	フィッシャー・バイオリエージェント	BP1427-500	細菌の増殖