動物サンプルを含むすべての手続きは、適切な動物倫理審査委員会によって審査・承認されています。
1. プローブ準備
- プローブのPCR増幅
- Porphyromonas gingivalis特異的プローブについては、P. gingivalis 16S rRNAのゲノムDNAと以下のプライマー(5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3'および5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TAT TC-3')を用いて、P. gingivalis 16S rRNAの343塩基のDNA断片を増幅します。以下のサイクル条件で増幅を行います:95°Cで35サイクル30秒、60°Cで30秒、72°Cで1分20秒、その後72°Cで5分間延長します。
- オリゴヌクレオチドとして合成された70塩基のDNA断片(5'-CAGGTGTGTCATGGGTGTCGTCGTGAAATGTGTGTTAAGCCGCAACGGGGCAACCC-3')と以下のプライマー(5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3'および5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3')を用いて真細菌プローブを増幅します。以下のサイクル条件で増幅を行います:94°Cで40サイクル30秒、60°Cで30秒、72°Cで1分20秒、その後72°Cで5分間延長します。
- PCR産物(≥500μl)を沈殿させ、酢酸ナトリウム3M(pH 5.2)と100%エタノール(10:1:2の比率)を加え、-20°Cで2時間培養します。
- 混合物を14,000 x gで15分間遠心分離し、ペレットをトリスエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)またはTEバッファー100μlに再懸浮させ、260 nmの光学密度でDNA濃度を測定します。
- DIG DNA標識検出キットを用いたジゴキシゲニン(DIG)標識
- プローブ3 μgを水と混合し、最終体積は15 μlにします。
- DNAを95°Cで10分間変性させ、氷の上で素早く冷やします。
- 変性DNA15μlに10xヘキサヌクレオチドミックス2μl、デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)標識ミックス2μl、クレノウ酵素1μlを加えます。
- 37°Cで24〜48時間培養し、65°Cで加熱して反応を止めます。
- DIG DNA標識検出キットを使って、DIG標識プローブの感度を確認してください
- キットに付属の陽性対照プローブを1μlのシリアル希釈液と、DIG標識プローブ1ngをナイロン膜に手動で投与し、室温(RT)で5分間乾燥させます。
- 膜を2倍の塩水-クエン酸ナトリウム(SSC)バッファー(0.3 M塩化ナトリウムまたはNaCl、30 mMクエン酸ナトリウム、pH 7.0)に短時間浸け、80°Cで1時間培養してDNAを固定します。
- 膜をマレ酸バッファー(MAB、0.1 M マレ酸、0.15 M NaCl、pH 7.5)に短時間浸け、キット内のブロッキング溶液6 mlに希釈(1:5,000)した抗DIGアルカリホスファターゼ(AP)結合抗体をRTで30分間培養します。
- 膜をMABT(1%Tween 20を含むMAB)で洗浄し、40μlのニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ4-クロロ-3'-インドリルリン酸塩(NBT/BCIP)溶液と2ml検出バッファー(0.1 M トリス(ヒドロキシメチル)塩酸塩酸塩トリス、0.1 M NaCl、0.05 M マグネシウム塩化物またはMgCl2、pH 9.5)を1分間膜に塗布します。ラベル付きプローブの感度が満足できない場合は、1.1.3から1.3.4までのステップを繰り返します。
- 標識プローブ(OD260)のDNA濃度を測定し、濃度を100 ng μl-1に調整します。
- DIGラベル付きプローブの特異性を確認してください
- 特定のプローブ対象の細菌を含む様々な細菌種のゲノムDNAサンプル(25 ng 3 μl-1)を95°Cで10分間変性させ、氷の上で素早く冷却します。
- 変性DNAをナイロン膜に手動で装着し、RTで20分間乾燥させます。
- 膜を2回のSSCバッファーに短時間浸し、80°Cで2時間培養してDNAを固定します。
- RTでブロッキング溶液で膜を1時間ブロックします。
- プローブを1 ng μl-1でハイブリダイゼーションバッファーで希釈し、希釈したプローブを変性させて膜に塗布します。
- 膜を45°Cで1時間培養します。
- 膜を2回SSCバッファーで3回洗います。
- 膜をMABに短時間浸します。
- 抗DIG結合抗抗がんAP結合抗体を希釈(1:2,000)6mlのブロッキング溶液にRTで1時間インキュベートします。
- 膜をMABTで洗浄し、NBT/BCIP溶液40μlと2ml検出バッファーを混ぜて塗布します。
- プローブが期待される特異性を達成できない場合は、特異性が観察されるまでハイブリダイゼーション温度を上げます。
2. 現場 交配
注意:試料や試薬の乾燥を避けるため、すべての培養は湿ったペーパータオルで覆った加湿チャンバーで行ってください。
- パラフィン化および組織切片の再水和
- パラフィン埋め込みブロックから厚さ4μmの組織切片を準備します。ホルマリン、パラホルムアルデヒド、亜鉛系固定剤はこのプロトコルと両立しています。
- すべての試薬はジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水で準備してください。
- 60°Cのドライオーブンで30分間加熱し、RTで30分間培養します。
- 100%キシレンに5分間スライドを3回浸します。毎回新鮮なキシレンを使ってください。
注意:この脱ワックスの手順は化学換気フードで行ってください。 - 100%エタノールに5分間スライドを2回浸け、それぞれ新鮮なエタノールを使用し、試料を90%、80%、70%のエタノール溶液を連続で5分間再水和させます。
- スライドをDEPC処理水に1分間浸し、DEPC処理されたリン酸塩緩衝塩水またはPBS(pH7.4)で6分間洗浄します。
- 組織切片の前処理
- スライドを0.1N塩酸に20分間浸し、DEPC処理水で30秒洗います。
- ワックスペンを使って標本の周囲に疎水性のバリアを描きます。
注:疎水性バリアの大きさは標本のサイズによって異なります。したがって、以下の工程で使用される試薬の体積は試料の大きさによって異なりますが、疎水性バリアを満たす必要があります(小型試料は50μl、大型試料は400μl)。 - 標本を50〜400μlのプロテイナーゼK(DEPC処理PBSで1〜10μgml-1)を37°Cのドライオーブンで30分間処理し、DEPC処理済みPBS1枚でスライドを1分間洗浄します。
- DEPC処理PBSに4%パラホルマルデヒドを10分間浸け、その後DEPC処理PBSで1分間スライドを洗浄します。
- スライドを0.1 MのトリエタノールミンHCl(pH 8.0)に0.5%無水酢酸を含む20分間浸し、その後DEPC処理水で30秒洗います。
- プローブとのハイブリダイゼーションと洗浄
- スライドを2つのSSCバッファーに20分間浸してください。
- プローブを1 ng μl-1 でハイブリダイゼーションバッファー(4×SSC、50%[vol/vol]ホルマミド、1×デンハルト溶液、10%[wt/vol]デキストラ硫酸塩、0.1%[wt/vol]硫酸ナトリウムドデシル、0.4mg ml-1サケ精子DNA)で希釈します。陰性対照の場合は、標識済みプローブと標識されていないプローブを10倍余分の量混ぜます。
- 希釈したプローブを変性させ、50〜400μlを組織切片に塗布します。スライドにカバースリップを貼り、ネイルポリッシュで密封します。
- PCRマシンで90°Cで10分間加熱スライドし、加湿チャンバーで45°Cまたはステップ1.4.11で最適温度で一晩キュベートします。
- スライドを4°Cで30分間冷却し、カバースリップを外して、スライドをシリアルSSCバッファーに浸します。以下の通りです:SSC4枚を10分、予備加熱(45°C)のSSCを20分、SSCを2枚10分、SSCを10分、0.2枚のSSCを10分間。
- 抗DIG結合抗体による検出
- MABTでスライドを5分間洗います。
- ブロッキング液50〜400μlで1%のTween 20を20分間ブロッキングします。
- 50〜400μlの抗DIG-AP抗体をブロッキング溶液(1:1,000)で希釈し、37°Cで90分間培養します。
- MABTでスライドを10分間洗います。
- 検出バッファーに1%のTween 20を含むスライドを5分間浸します。
- 1 mMレバミソールを50〜400 μl(検出バッファー内1%トゥイーン20を含む)で5分間処理し、内因性アルカリホスファターゼを不活性化します。
- 各試料に50〜400μlのNBT/BCIP溶液(検出バッファーで希釈)を塗り、加湿チャンバーでRTで2〜3時間培養し、発現信号が満足するまで培養します。
- スライドを脱イオン水ですすぎて視覚化を止め、37°Cで10分間カウンターステインとして0.05%(重量/体積)のメチルグリーンを50〜400μl塗布します。
- 脱イオン水でスライドをすすぐ後、100%エタノールで脱水し、キシレンに浸します。
- 各スライドに80μlの取り付け液を塗布し、カバースリップで覆います。
