生物発光を用いたマウスモデルにおける細菌感染のリアルタイムイメージング

要約

出典: Valentine, M. E.ら、『 緑膿菌 におけるインフレーム遺伝子欠失変異体の生成および感染の単純なマウスモデルにおける病原性減損の検証』。 J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、生マウスモデルにおける細菌感染を監視するために、生物発光ベースのイメージング手法を用いる方法を示しています。逐次生物発光およびX線画像により、宿主全体に広がる感染のリアルタイムの可視化と解剖学的局在化が可能です。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

生物発光による感染の可視化

1. 感染の進行を可視化するために、試験対象の緑膿菌株(Pseudomonas aeruginosa)PGN5およびVE2株に染色体生物発光オペロン(luxCDABE)を挿入します。これらの菌株を標識するために用いられたプラスミドとプロトコルはシュワイツァー研究所で開発されており、すべての細菌種や菌株に適合しているとは限りません。重要なのは、感染の可視化は任意であるということです。したがって、死亡率研究を行うためにこのオペロンのゲノム挿入は必須ではありません。
2. 品種を準備し、検証しましょう。さらに、各検証ステップで標識株の生物発光も確認してください。
3. 株が準備されたら、上記の手順に従って10匹ずつのグループで生物発光株を注射します。
4. 動物の発光能力を持つ動物イメージングシステムを用いて、3時間ごとに24時間ごとに動物を撮影します。
   1. まず、カメラのパラメータを設定し、動物用のステージを加熱してイメージャーを準備します。次に、酸素流量を1.5L/分に設定するか(メーカーの推奨に従うか)してください。
   2. イメージャーとステージが安定化した後、注射直後にマウス1匹を麻酔チャンバーに入れ、約4分間_O2 流量で3.5%イソフルランを投与します。麻酔方法は使用されるチャンバーや麻酔薬によって異なる場合があります。メーカーの推奨に従いましょう。離脱反射検査で適切な麻酔を判断してください。
   3. マウスを温度安定化段階に移します。マウスを仰向けにして腕を伸ばし、画像診断中に2.5%イソフルランを投与するための鼻錐を装着します。
   4. ドアを閉めて、ネズミの発光画像とX線を撮ってください。
   5. 画像診断が終わったら、マウスをケージに戻して監視します。マウスは3〜5分以内に意識を取り戻すはずです。
   6. マウスを3時間ごとに24時間撮影し、毎回グループごとに異なるマウスを使って撮影を続けます。麻酔再曝露による副作用の可能性があるため、24時間以内にマウスを再画像化しないでください。1匹のマウスは24〜36時間ごとに麻酔を1回だけ受けるべきです。各マウスを撮影した後は、イメージングプラットフォームを清掃してください。撮影時点の間でイメージャーの電源を切ってください。
      注: 生物発光は注入された菌株に関わらず消えます。生物発光の強度や持続時間は、注入される細菌の数、マウス株、細菌株など多くの要因によって異なります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Accuブロック デジタルドライバス	ラボネット	NC0205808	フィッシャー・サイエンティフィック経由
キャビネットインキュベーター	VWR	1540
アイソセジア・イソフルラン	ヘンリー・シャイン動物保健	29405
IVIS ルミナXRMS Series III In Vivoイメージングシステム	パーキンスとエルマー	CLS136340
マイクロパルサー電気孔孔器	バイオラッド	1652100
プリズム7	グラフパッド		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
SmartSpec Plus分光光度計	バイオ・ラッド	170-2525	または推奨する方法/ベンダー
XAF-8 麻酔システムフィルター	パーキンスとエルマー	118999
XGI 8 ガス麻酔システム	キャリパー生命科学/ゼノゲン