生物発光を用いたマウスモデルにおける尿路感染症の可視化

要約

出典: Luyts, N. ほか。 マウスにおける尿路感染症の縦断的追跡調査およびマウスにおける治療法。 J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオは、膀胱に注入した発光 性大腸菌 をマウスモデルで誘導し、細菌の付着、侵入、細胞内複製を誘導・追跡する方法を示しています。生物発光オペロンから放出される光は、感染進行中の細菌負荷のリアルタイムのマーカーとして機能します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物への予防接種

1. 動物の調理
   1. 研究課題やノックアウトラインの入手可能性、実験の詳細、UTI感受性の違いに応じて、望ましいマウス株を選択します。メスのマウスでは経尿道カテーテル挿入が比較的容易であることを覚えておいてください。8週未満の動物は免疫学的に未成熟であるため使用しないでください。ここでは、12週齢の雌のC57Bl/6Jマウスを使用しました。
   2. 動物は十分に前もって注文し、理想的には7日間慣れさせてください。グループ動物は個別に換気されたケージで、標準的な12時間の明暗条件下で飼育します。
   3. 動物の腹部を剃り、信号の喪失を抑えましょう。脱毛クリームは動物の皮膚をすぐに焼く可能性があるため、使用しないでください。利き手で剃りながら、利き手でない手で首根と後ろ肢をしっかり押さえて動物を拘束します。あるいは、イソフルラン麻酔下で剃る方法もあります。
      注: 動物は画像検査の2日前に剃られ、剃られた部分をさらにグルーミングする予定です。
   4. 実験中は水と通常の食事を 自由に 提供してください。ただし、膀胱容量を減らすために、挿入の2時間前からは動物に水分を与えないようにしてください。
   5. 滅菌された24Gの血管カテーテル先端を100μLの注射器に装着し、細菌溶液を注射器に注ぎます。
      注: 背景の発光を決定するには、インフレーション前に基準画像を取得してください(下記のステップ2参照)。
2. 動物の入り込み
   1. 動物を誘導チャンバーに入れ、純酸素をキャリアガスとして含んだイソフルラン吸入(誘導3%、維持1.5%)で麻酔します。
   2. 1匹の動物を仰向け状態で作業台に置き、点滴中は鼻のコーンを使って安定したイソフルラン麻酔を維持します。眼軟膏を塗ってください。
   3. 残留尿は優しく圧迫し、恥骨上方に円を描くように運動して排出します。挿入前に下腹部を70%エタノールで洗浄してください。
   4. カテーテルの先端を生理食塩水で潤滑してください。利き手でない方の人差し指を腹部に置き、優しく押し上げます。尿道のカテーテル挿入を90°(垂直方向)で開始し、抵抗が見つかったら水平に傾けてからさらに0.5cm挿入します。
      注: カテーテルを無理やり押さないでください。これは尿道に害を及ぼします。カテーテル挿入には優しく回す動作が役立ちます。一方で、抵抗がない場合は膣への挿入が誤っていることが多いです。
   5. 細菌接種剤50μL(2×10⁷ CFU)をゆっくり(5 μL/s)挿入します。
      注: 大量投与や挿入速度が速くなると腎臓に逆流を引き起こす可能性があります。この技術の練習中は、青インクを使って逆流を評価できます。
   6. 挿入後は、注射器とカテーテルを数秒間そのままにし、漏れを防ぐためにゆっくりと引っ込めます。大量の漏れや血尿道などの異常があれば記録し、必要に応じて動物は除外してください。
   7. 動物をイメージングチャンバーの鼻錐で仰向けの状態に位置させ、残りの動物に対して先述の手順1.1.1-1.1.6を繰り返します。実験グループごとにカテーテルを1本使います。麻酔は継続し、最初の動物と最後の動物の間の時間を最小限にしてください。
   8. 必要に応じて、画像検査の前後に抗生物質や実験薬を投与してください(ステップ2)。例えば、エンロフロキサシンを投与するには、エンロフロキサシン溶液40 μL(100 mg/mL)を生理用生理食塩水3.96 mLに加え、1/100希釈を得ることができます。午前9時と午後5時に100 μL/10 gを皮下注射し、10 mg/kgのエンロフロキサシンを1日2回、3日間投与します。

2. 生物発光イメージング

1. イメージングパラメータの準備と選択
   1. BLI取得ソフトウェア(材料表参照)を開き、イメージング装置の「初期化」(材料表参照)をクリックして、カメラとステージコントローラーシステムのテストを行い、CCDカメラを-90°Cまで冷却します。
      注: この過程ではドアが施錠され、初期化の進行状況はコントロールパネルで追跡できます。緑色のランプは気温が-90°Cに達したことを示します。初期化完了前に画像撮影が試みられると警告が表示されます。
   2. データが自動保存されていることを確認してください:取得自動保存をクリックして正しいフォルダを選択してください。
   3. ルミネセンスとフォトを選択してください。デフォルトの発光設定を確認してください:励起フィルターをブロックに、発光フィルターを開いてください。
   4. 最初の画像を撮る際、特に暗い信号を予想する場合は露出時間をオートに設定し、十分な光子数を確保するようにしてください。 生体内 測定や明るい信号の場合は、露光時間を~30秒に設定してください。画像が彩度が高い場合は警告が表示されます。もしそうなったら、曝露時間を短縮してください。
   5. 中程度のビニング、F/ストップ1を選択し、正しい視野角(FOV)(5匹の動物用D)を選びます。
   6. マウスを撮る際は被写体の高さを1cmに設定します。
   7. 取得コントロールパネルで「追加」を3回クリックすると、技術的な再現として3枚の画像の連続が表示されます。
2. イメージング
   1. マウスを画像室で仰向けに置き、実験中はマニホールドの鼻錐を使って麻酔(イソフルラン1.5%)を維持します。最大5匹のマウスを同時に撮影し、反射を防ぐためにライトバッフルで動物を分けます。
   2. ドアを閉めて取得ボタンをクリックすると画像シーケンスが始まります。
   3. 実験の詳細(野生型とノックアウト動物、治療法、画像撮影日など)を記入してください。露出時間などのイメージング設定は自動的に保存されます。
   4. ネズミを画像室から取り出し、ケージに戻します。麻酔後の完全な回復を確認しましょう。数分以内に動物たちは完全に目を覚まし、探索を始めるはずです。鎮痛剤はUTIの治療に支障をきたす可能性があるため避けてください。
   5. ケージは次の撮影サイクルまで換気されたラックに戻してください。実験終了後、_CO-2 窒息または子宮頸部脱臼によって動物を安楽死させます。これはイソフルラン麻酔の回復前に行い、苦痛を最小限に抑えましょう

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔用ヴェポライザー	ハーバード・アパラタス・リミテッド	該当なし	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
ベイトリル 100 mg/mL	バイエル	該当なし	エンロフロキサシン
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	黄色い血管カテーテル、挿入には滅菌プラスチックの先端を使います
C57Bl/6Jマウス	ジャンヴィエ	該当なし
遠心分離機5804R	エッペンドルフ	EP022628146
ドロップセンス16	アンチェインド研究所	トリニー	外径600nmを測定するために
ダルベッコのリン酸塩緩衝塩水、Gibco	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	参考文献 14040-083
エタノール70%変性5L	VWRインターナショナル	85825360
Falcon 14ml 丸底ポリスチレンチューブ、スナップキャップ	コーニング	352057
Falcon 50ml cellstart	グライナー	227285
ハミルトンガスタイトシリンジ、PTFEルアーロック、100μL	シグマ・オルドリッチ	26203	50μLの細菌注入を遅くするために
接種ループ	ロス	6174.1	ホルダー:アート。番号6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	デクラ獣医製品	該当なし	イソフルラン
IVISスペクトラムIn vivoイメージングシステム	パーキンエルマー	参考124262	イメージング装置