植物細胞への遺伝子送達のための アグロバクテリウム 培養の調製

要約

出典: Shi, J. ら、 植物病原体の分泌効果子からのRNAサイレンシング抑制因子のスクリーニングと同定。 J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオでは、ア セ トシリンゴンで病原性遺伝子発現を誘導し、その後洗浄と再懸濁によって抗生物質を除去することで、植物組織への遺伝子送達に適した形質転換に適した懸濁液を生成する過程を実演しています。

プロトコル

1. 浸透のためのアグロバクテリウム培養の準備

1. Luria-Bertani(LB)プレートから陽性コロニーを選び、50 μg/mLのカナマイシンと50 μg/mLのリファンピシンを補足した5 mLのLB培地を含むガラス管に細胞を接種します。細胞を30°Cで200rpmで振って24−48時間培養します。
2. 100μLの培養液を、同じ抗生物質、10 mM 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES; pH 5.6)、および20 μMアセトシリンゴン(AS)を補足した5 mLのLB培地に移します。30°Cで200rpmで振って16−20時間細菌を培養します。
3. 遠心分離機セルを4,000 x g で10分間使用します。上清液を注ぎ、ペレットを10 mM_MgCl2 バッファー2 mLに再懸浮させます。
4. 抗生物質を完全に除去するためにステップ1.3を繰り返します。
5. 600 nm(OD₆₀₀)で光学密度を測定してアグロバクテリウム培養の密度を決定します。OD₆₀₀を1.5−2.0に調整し、10 mM_MgCl2バッファーを使用。
6. 最終懸濁培養液に10 mM MES(pH 5.6)と150 μM ASを加え、少なくとも3時間振らずにRTで培養します。
   注: 最終的な懸濁培養は一晩放置しないでください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-モルフォリノエタンスルホン酸(MES)	バイオフロックス	1086GR500	バッファー
アセトシリンゴン(AS)	シグマ・オルドリッチ	D134406-5G	アグロバクテリウムの誘導
寒天	シグマ・オルドリッチ	A1296-1KG	LBミディアム
バクト・トリプトン	BDバイオサイエンス	211705	LBミディアム
バクト酵母抽出	BDバイオサイエンス	212750	LBミディアム
カナマイチン硫酸塩	シグマ・オルドリッチ	K1914	抗生物質
リファンピシン	MPバイオメディカル	219549005	抗生物質
塩化ナトリウム	アムレスコ	0241-10KG	LBミディアム