細菌感染の可視化のためのマウス膀胱組織の準備

Abstract

出典:オブライエン、V. P.ら、マウスにおけるガルドネレラ膣膀胱曝露によって引き起こされる再発性大腸菌尿路感染症。J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、感染前のマウスモデルの膀胱上皮における細菌の定着と宿主–病原体相互作用を可視化するために走査型電子顕微鏡を用いる方法を示しています。

Protocol

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 走査型電子顕微鏡による膀胱イメージング

   注: この手技は、尿路皮の可視化が望ましい任意の時点で行うことができます。 図1 (紫色のボックス)に示されているように、尿路病原性大 腸菌 (UPEC)と尿路皮の相互作用は、UPEC接種後6時間から24時間の貯蔵池形成期に最もよく観察され、 Gardnerella 膣炎によって引き起こされる尿路上皮剥離は、2回目のG . vaginalis 曝露後3時間から12時間の間に最もよく観察されます。

   1. 定所 膀胱固定術
      1. 膀胱収穫直前に、pH7.4_の 0.15Mナトリウムカコジル酸バッファーにグルターアルデヒド(2.5%最終)とパラホルマルデヒド(2%最終)を加え、固定液を準備します。開封したばかりのガラス製アンプルからパラホルマルデヒドとグルターアルデヒドを使用してください。両固定剤は開封容器内で時間とともに酸化します。注意: グルターアルデヒドは有毒で呼吸器刺激物であり、腐食性があります。パラホルムアルデヒドは可燃性で発がん性があり、刺激物であり、生殖毒素でもあります。カコジル酸ナトリウムは有毒で発がん性があります。
      2. 固定液50 mLを、16%パラホルマルデヒド6.25 mL、50%グルターアルデヒド2 mL、超純水16.75 mLを、pH 7.4の0.3 Mカコジル酸ナトリウム溶液25 mLと4 mM_CaCl2を加えます。
      3. 準備済みの固定液を膀胱に投与する前に37°Cまで温めてください。
      4. ツベルクリンのスリップチップ注射器に固定剤を注ぎ、カテーテルを先端に固定し、斜面は反対側の注射器のマークに向かいます。針の先端から1〜2mmの余分なチューブを切り取り、針先が露出しないように注意してください。シリンジをひねって気泡を取り除き、プランジャーを空の空気に押し込み、マイクロ遠心分離機管でカテーテルに固定剤を注いで固定液を集めて適切に処分します。
      5. 承認された方法(例:麻酔下の頸椎脱臼)を用いてマウスを麻酔し、犠牲にします。マウスを解剖面に置き、脚は輪ゴムやピンで固定します。鉗子と外科用ハサミでネズミの骨盤部分を開けて膀胱を露出させます。隣接する脂肪は慎重に押しのけて、膀胱はそのままにしておきましょう。
      6. 注射器は利き手で持ち、針は下向きに、針の面取りと注射器の刻印は自分から背を向けます。カテーテルの先端を滅菌潤滑剤に浸します。
      7. カテーテルの先端を尿道口に位置させ、注射器の本体に30〜45度の角度で持ち出します。
      8. 先端で非常に小さな時計回りの動きで下方向に圧力をかけ、カテーテルを優しく尿道に挿入します。カテーテルの先端が尿道に入ると、注射器をマウスの尾に向かってヒンジしつつ、注射器のバレルが作業面と平行になるまでさらに尿道の奥へ滑り込ませます。カテーテルの針軸全体(基部を除く)はマウスに入り、カテーテルの先端を膀胱腔内に位置させます。
      9. ゆっくり50〜80μLの固定剤を投与し、膀胱を風船のように膨らませます。カテーテルをそのままにし、注射器を少し持ち上げて先端を上に傾けます。
      10. もう一方の手で止血鉗を開き、尿道の交差点でカテーテル針の下に一本の針を滑り込ませます。止血剤を部分的に閉じて、針に触れる程度にしてください。
      11. カテーテルの針を膀胱から優しく引き抜きつつ、同時に止血剤の流出を防ぐために止血止めを完全に締めてロックしてください。
      12. 止血器を作業面と平行に握り、膀胱をその上に置きます。止血栓(膀胱の反対側)の下を優しく、慎重に切り上げて止血栓を取り外します。
      13. 膀胱と固定剤を温めた固定剤入りのファルコンチューブに入れます。膀胱が液体に完全に浸かり、チューブの壁に押し付けられていないことを確認してください。4°Cで24時間培養します。
   2. 走査型電子顕微鏡(SEM)による膀胱処理およびイメージング
      1. 洗浄された両面カミソリの刃で矢状状に膀胱を二分し、止血鉗に接線方向にもう一切って膀胱を解放します。これにより、2つの半膀胱型「カップ」ができます。もし膀胱の外側に脂肪パッドが残っている場合は、優しく取り除いてください。
      2. 膀胱の半分を3回(各10分)ナトリウムカコジレート緩衝液(0.15 M、pH 7.4)で洗い流します。
      3. 0.15 Mカコジレート緩衝液に1%四酸化オスミウムを室温で1時間染色します。オスミウムは光に敏感です。したがって、染色容器をホイルで包んで暗い環境を保つためにこの工程を行うのが良いでしょう。​
         注意: 四酸化オスミウムは皮膚に有毒で腐食性があります。このステップは手袋をしてフムフード内で行ってください。
      4. 膀胱の半分を超純水で3回(各10分)すすぐ。これらの工程では、水面に浸透油が見られることがあります。乾燥作業中の汚染を防ぐために、吸い取りまたはウィッキングで除去してください。
      5. エタノールの段階を分けた系列(50、70、90、100、100%)にそれぞれ10分間浸して脱水します。
      6. クリティカルポイント乾燥機を使い、最も遅い速度で12回の_CO2 交換を行い、固定組織を乾燥させます。換気ステップ以外はすべての追加設定を遅く設定してください。換気ステップは速い設定にしています。
      7. 清潔な両面カミソリで各膀胱の半分を再び二分に切り、標本の曲率を減らし、より効率的なコーティング、SEMでのイメージングの容易さ、乾燥中に反った可能性のある組織を露出させるために合計4つの部分を作ります。
      8. ブラダーパーツをアルミのスタブの導電性カーボン接着タブに貼り付け、爪楊枝で接点の底面に少量の銀色接着剤を塗り、過剰な接着剤がブラダーの内側に付着しないように注意してください。
      9. 高真空スパッターコーターを使って、サンプルスタブに6nmのイリジウムをスパッターコートします。試料が充電し続ける場合は、銀色塗料で導電経路を表面まで塗り、さらに4nmのイリジウムを塗り付けてください。
      10. 走査型電子顕微鏡で試料を画像化してください。使用される顕微鏡によって条件は異なりますが、3 KeVの加速電圧、ビーム電流200 pA、作業距離12〜13 mmのものが、Everhart-Thornley(SE2)電子検出器を使用したZeiss Merlin FE-SEMで良好に機能しました。

Results

図1。マウスモデルの回路図。タイムラインはプロトコル で示されたモデルの段階や手順を反映するために強調表示されます。フェーズ1(オレンジ):細胞内尿路病原性 大腸菌 (UPEC)リザーバーの確立。マウスにはUPECを経尿道接種し、尿検査を採取・監視して細菌尿の除去を行っています。細菌を除去したマウスだけが次の段階に進みます。フェーズ2(緑):ガ ルドネレラ膣への膀胱曝露。マウスには G. vaginalis を経尿道的に2回接種します。...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G×1/2針	BD	305106	カテーテル用
5 1/2インチのストレートピンセット止血鉗子	マッケソン	487377	定所膀胱固定術
ACE 600 スパッターコーター	ライカ		SEMサンプル処理
アルミニウムSEMスタブ	テッド・ペラ	16111	SEMサンプル処理
塩化カルシウム	EMS	12340	定所膀胱固定術
導電性カーボン接着タブ	テッド・ペラ	16084-1	SEMサンプル処理
導電性銀塗料	テッド・ペラ	16034	SEMサンプル処理
CPD 300 クリティカルポイントドライヤー	ライカ		SEMサンプル処理
サイトファネル金属クリップ	インポート	M964B	サイトスパン尿検査
エタノール	EMS	15050	SEMサンプル処理
グルコース	シグマ	G7528	NYCIII G. vaginalis増殖培地について
グルターアルデヒド	EMS	16320	定所膀胱固定術
Hema 3染色キット	フィッシャー	23123869	サイトスパン尿検査
ヘペス	セルグロ	25-060-CL	NYCIII G. vaginalis増殖培地について
イリジウム	テッド・ペラ	91120	SEMサンプル処理
マーリンFE-SEM	ツァイス		走査型電子顕微鏡
ミリQ浄水器	ミリポール	IQ-7000	SEMサンプル処理
四酸化オスミウム	EMS	19170	SEMサンプル処理
パラホルムアルデヒド	EMS	15710	定所膀胱固定術
ポリエチレンチューブ	イントラメディック	427401	カテーテル用
プロテオス・ペプトン #3	フィッシャー	DF-122-17-4	NYCIII G. vaginalis増殖培地について
PTFEコーティングされた両刃カミソリ刃	EMS	72000	SEMのための膀胱切断