ゼブラフィッシュ胚からの細菌の単離および培養による感染負荷の評価

要約

出典: Bernut, A.ら、ゼブラフィッシュ胚における マイコバクテリウム・ブスペサスの 病因解析および解析。J . Vis. Exp. (2015)。

このビデオは、感染したゼブラフィッシュ胚から マイコバクテリウム 膿瘍を単離し定量するプロトコルを示しています。この処置は胚の安楽死、組織溶解、均質化による細菌の放出を含み、その後遠心分離と界面活性剤バッファー内での再懸濁処理を行います。最後に、細菌の懸浮液を連続的に希釈し、抗生物質補充の寒天にプレートし、培養してコロニー形成と定量を可能にします。

プロトコル

1. M. abscessus接種点の調製と保存
   1. M. abscessus の成長条件
      1. -80°Cのグリセロールストックから M. abscessus を、OADCを10%、グリセロール0.5%を含むMiddlebrook 7H10寒天(7H10OADc)にプレートで塗り出し、蛍光タンパク質をコードするベクターが持つ抵抗性マーカーに応じて適切な抗生物質を補足します。プレートは30°Cで4〜5日間孵化します。
      2. 蛍光陽性のマイコバクテリアコロニーを入手し、1mlのミドルブルック7H9ブロスにOADC、0.2%グリセロール、0.05%トゥイーン80(7H9OADc/T)と必要な抗生物質を添加し、15mlの滅菌プラスチックチューブに接種します。30°Cで1週間、振らせずに培養します。
         注: トゥイーン80は凝集や細菌の集まりを制限します。
      3. 2.1.2 mLのミドルブルック7H9OADc/Tで得られた前培養液を、150 cm2の組織培養フラスコに再懸浮させ、最終0.1 OD₆₀₀ (約5.107 Bacteria/mlに相当)にし、さらに30°Cで4日間培養して指数関数的に増殖する培養(OD₆₀₀ = 0.6から0.8)を得る。
         注: 特に粗い変異株の凝集を最小限に抑えるため、潜伏期間は5日を超えないようにしましょう。滑らかなものも粗いものも、成長速度は似ています。
2. M. abscessus接種の調製
   注: 粗い M. abscessus は大きな集合体を形成し、臍帯を形成しやすいため、胚に顕微注射を行う前に均質かつ定量的に制御された接種点を生成するために特定の処理が必要です。この処理は、粗い株ほどの程度は少ないものの、凝集体を産生する滑らかな細菌にも適用されます。
   1. 150 cm2の組織培養フラスコから指数関数的に増殖する培養液を、4,000 x gの遠心分離で50 mlの滅菌プラスチックチューブ内で15分間RTで採取し、細菌ペレットを1 ml 7H9OADc/Tに再懸濁します。200μlの細菌懸濁液を1.5mlのマイクロ遠心分離機チューブにアリコートします。
      注: 1mlのシリンジで少量を扱うことで、非常に均質な懸濁液を得る必要があります。
   2. 細菌懸濁液を26G針(上下15回)で均質化し、水浴ソニックケーターを使って10秒間(各超音波処理の間に10秒の休憩を挟み)3回超音波処理を行います。7H9OADc/Tを1ml加えて短時間ボルテックスします。遠心分離機で3分間、100 x gで加熱します。
   3. マイコバクテリアを含む上澄液を注意深く集めて塊を防ぎ、均質な懸濁液を50mlの滅菌プラスチックチューブにまとめます。
   4. 最終的に残る細菌の集合体がないか目で確認してください。
      注: もし集合体がまだ残っている場合は、100 x gで2分間の遠心分離を行い、上清液を採取します。
   5. 懸濁液を4,000 x gで5分間遠心分離し、ペレットを200 μl 7H9OADc/Tに再懸浮させて注入に進みます。
   6. 7H10OADc寒天に連続希釈(1xPBST)をプレートし、30°Cで4日間の培養後にコロニー形成単位(CFU)を計数することで最終細菌濃度を評価します。各新しいバッチごとにCFUを決定する必要があります。
   7. 凍結接種用ストックは、5μlアリコートを-80°Cで保存して準備します。
      注: -80°Cの凍結アリコートのCFU評価は、接種物の生存率に影響を及ぼす可能性があるため、生存可能な細菌の正確な数を決定するための前提条件です。これらの凍結接種は、次の注射に使える状態です。すべてのアリコットは同じ量のCFUを含むため、実験ごとに細菌を再現性のある方法で注入することが可能です。
3. 接種物の品質管理
   注: ツィール・ニールセン染色法(菌類に特有)は、均質化手順の前後の細菌懸濁液の品質を比較するために用いられます。
   1. 均質化された細菌懸濁液の一滴をガラススライドに点滴して広げ、完全に乾燥させます。65〜70°Cに設定したホットプレートで少なくとも30分間塗りつけ、Ziehl-Neelsen染色プロトコルでステインを塗ります。
   2. 100倍対物レンズを使った顕微鏡で細菌塗り跡を観察し、未処理の細菌懸濁液の塗抹と比較します (図1)。

2. ゼブラフィッシュ胚の準備

1. ゼブラフィッシュの産卵と採卵
   1. 産卵前日には、オス2匹とメス1匹(通常2:1の比率で最適な受精率)を繁殖室に入れ、卵収集バスケットを備えた別の水槽に入って繁殖させます。
      注: 卵収集バスケットは、親鳥が卵を食べないように保護し、卵の採取を促進するために使用されます。
   2. 1 hpfで、卵子と適切に発育した胚のみを100mmのペトリ皿に25mlの青魚水(1皿最大100個)を満たし、28.5°Cで保管します。受精していない卵は廃棄します。
2. ゼブラフィッシュ胚の注射準備
   1. 受精後約24時間(hpf)に、100mmのペトリ皿で細いピンセットで胚を脱毛し、28.5°Cで保温します。
   2. ピペットで30〜48 hpfの胚を採取し、270 mg/Lトリカインを含む25mlの魚水を入れた「V」字型のポジショニングチャンバーに移します。自作のマイクロローダーチップツール(自作のクリップ型マイクロローダーチップ)を使って、胚を正しくチャネルに置き、マイクロ操作が容易に最適化されています。
      注: 尾静脈への静脈注射では背側を下向きに、尾筋注射では背側を上向きに配置します。

3. マイクロインジェクション手技

注記:M . abscessus 感染の年代(生存率、細菌量、動態、感染特性)を評価するためには、30 hpf胚の尾静脈注射が推奨されます。免疫細胞の動員を可視化するために、48 hpf胚の尾筋など局所的な部位に注射が行われます。

1. 注射の適切を確認するために、1xPBSTで1xPBSTを希釈し、10%の赤色フェノールを含みます。
2. マイクロローダーの先端を使って5〜10μlの細菌接種液をマイクロキャピラリー注射針に装填し、マイクロインジェクション針をインジェクターに接続された三次元マイクロマニピュレーターのホルダーに接続し、細いピンセットで針の上部を折って直径5〜10μmの開口部を得ます。
3. マイクロインジェクション圧力(20-50 hPa)と時間(0.2秒)を調整して注入量を校正します。
   注: 必要な注入量は、胚の黄身に排出された液滴の直径を目視で測定することで校正されます。
4. 尾静脈注射の場合、胚の腹側を針に向けさせ、針先を尿生殖器の開口部近くに置き、尾静脈を狙い、針先を優しく胚に押し込み、尾静脈をわずかに貫通させます。通常は1〜3 nl、約100 CFU/nlを含む所定の細菌調製液を投与します。
5. 筋内注射の場合は、胚の背側を針に向けさせ、針を片側の体節に当てて、少量(1 nl)の接種剤を注入します。
   注: 尾静脈注射についても、筋肉内注射は実施が難しいです。過負荷を避けるために周囲の組織を傷つけるよう注意が必要です。
6. 注射手順の最後に、同じ量の細菌懸浮液を無菌PBSTの滴に注入し、その後7H10OADcにプレートを施し、CFUを数えることで接種量を制御します。約100個の胚を針で注射できます。
   注: 粗い M. abscessus は針内で凝集を形成し続ける可能性があるため、接種剤の準備直後に注射を行う必要があります。
7. 感染した魚を1井戸あたり2mlの魚水を含む24ウェルプレートに個別に移し、28.5°Cで培養します。1-3 nl 1X PBSを注入した胚を対照群として使用できます。
8. 胚内の蛍光菌の適切な感染は蛍光顕微鏡を用いて監視されます。

4. 細菌負荷の定量化

1. CFU列挙による決定
   1. 所定の時刻で、感染した胚のグループ(各条件5個)を1.5mlのマイクロ遠心分離管(1個の胚/チューブ)で採取し、胚を氷上で10分間培養して凍結麻酔し、トリカイン(300-500 mg/L)の過剰投与で安楽死させます
   2. 胚を滅菌水で2回洗浄し、新しいチューブに入れて投与してください。26-Gの針を使って2%トリトンX-100を1X PBSTで希釈して各胚を溶除し、懸濁液を均質化して完全に溶解させます。サスペンションを遠心分離し、ペレットを0.05%トゥイーン80のPBSTで再懸浮させます。ホモジネートの連続希釈はMiddlebrook 7H10OADcにメッティングされ、供給者の推奨によりBBL MGIT PANTAで補給されます。
      注: M. abscessus はM . marinum よりもNaOH処理に感受性が高いです。BblのMGIT PANTA抗生物質カクテルを用いて、M . abscessus の成長に影響を与えずに魚の溶解液の除染を成功裏に行えます。
   3. プレートを30°Cで4日間孵化し、コロニー数を数えます。

結果

図1。分散した M. abscessus 接種 菌の調製。処理前(上部パネル)または処理後(下部パネル)にブロス培地上で培養したRまたはS変異体のZiehl-Neelsen染色は、サイリング、超音波検査、デカンテーションの連続工程でマイコバクテリア集合体のサイズと数を減少させます。細菌は100倍APOオイル1.4 NA対物レンズを用いて顕微鏡で観察されました。スケールバー:20μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BBL MGIT パンタ	BDバイオサイエンス	245114
牛血清アルブミン	ユーロメデックス	04-100-811-E
牛肝臓由来のカタラーゼ	シグマ・オルドリッチ	C40
ディフコ・ミドルブルック 7H10 寒天	BDバイオサイエンス	262710
ディフコ・ミドルブルック 7H9ブロス	BDバイオサイエンス	271310
エチル3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸塩(トリカイン)	シグマ・オルドリッチ	A5040
オレイン酸	シグマ・オルドリッチ	O1008
パラホルムアルデヒド	デルタ顕微鏡	15710
フェノールレッド	シグマ・オルドリッチ	319244
トゥイーン80	シグマ・オルドリッチ	P4780
寒天	ギブコ・ライフ・テクノロジー	30391-023
低融点アガロース	シグマ・オルドリッチ
即時の海塩	アクアリウム・システムズ社
ホウケイ酸ガラス毛細血管	サター・インストゥルメント社	BF100-78-10	外径1mm×内径0.78mm。
マイクロピペットプラー装置	サター・インストゥルメント社		フラミング/ブラウンマイクロピペットプラー p-87
マイクロインジェクター	トライテックリサーチ		デジタルマイクロインジェクター(MINJ-D)
ピンセット	サイエンス・ツールズ社		デュモン # M5S
マイクロローダーのヒント	エッペンドルフ