生存アッセイを用いたC. elegansにおけるエアロモナスの病因モデル化

要約

出典:Chen, Y. ほか。カエノラブディティス・エレガンスモデルにおけるエアロモナス感染の病原性と病因の評価。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、 C. elegans を用いて エアロモナスの 病因をモデル化する生存アッセイを示しており、経口摂取によって腸内感染や死亡を引き起こし、生きた宿主系における細菌の病原性を定量的に評価することを可能にします。

プロトコル

1. C. elegans エアロモナスを用いた生存アッセイ

1. E . coli OP50で拡散するENGM(濃縮線虫成長培地)にL1ミミズを播種する日に、4つの Aeromonas 株または大 腸菌 OP50の各コロニーを1つずつ採取し、それぞれ2 mLのLBブロスで37°Cで16時間培養します。
   注: 汚染を避けるために、この工程は層流フード内で行うべきです。ここでは以下の細菌株が使用されました:C. elegansの通常の食物源である E. coli OP50 。A. dhakensis AAK1、初の完全配列決定された臨床病原性 A. dhakensis 分離株。 A. ハイドロフィラ A2-066、 A. veronii A2-007、 A. caviae A2-9307121は国立成功大学病院の代表的な臨床分離株です。
2. 細菌ブロスの吸収率_OD600 (600nm時の光学密度)を測定し、LBブロスでOD₆₀₀ = 2.0に調整します。
3. 各6cmのNGM(線虫培養培地)プレートに30μLの細菌ブロスをスポットで塗布します。培地を室温で一晩培養してください。
   注: NGMを製製するには、3 gのNaCl(塩化ナトリウム)、2.5gの細菌ペプトン、20gの寒天を1Lの脱イオン水に溶かします。121°Cで20分間オートクレーブします。水浴で55°Cまで冷めた後、1 mLの1 M CaCl₂ (塩化カルシウム)、1 mLの1 M MgSO₄ (硫酸マグネシウム)、1 mLの5%コレステロール(エタノール)、25 mLのリン酸バッファーを加えます。よく混ざるようにぐるぐる回します。
4. L1寄生虫がL4段階に成長する日に、50匹の寄生虫をランダムに摘み取り、4つの Aeromonas 株または大 腸菌 OP50のいずれかをNGMプレートに移します。
5. NGMプレートを20°Cで培養し、アッセイが完了します。
6. 生きているミミズをすべて新たに準備したNGMプレートに細菌を入れて移し、生きている、死んだ、センサーのミミズの数を毎日数え、最後のミミズが死ぬまで続けます。
   注: 感染維持のために、毎日新鮮に準備されたNGMプレートに移管してください。滅菌された線虫(例:glp-4やFudR)を使用しても含まれます。
7. 日々のデータ計算に基づいて生存曲線をプロットします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シェイカーインキュベーター	イーダー	LM-570R	細菌の培養
NaCl	シグマ	31434	培養培地の調製
MgSO₄	シグマ	M7506	培養培地の調製
寒天	ディフコ	214530	培養培地の調製
CaCl₂	シグマ	C1016	培養培地の調製
コレステロール	シグマ	C8503	培養培地の調製
6cmペトリプレート	アルファ・プラス	46	寒天プレートの準備
細菌ペプトン	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	培養培地の調製
ファッド・ドリ	シグマ	1271008	培養培地の調製
顕微鏡システム	ニコン	エクリペーズTi逆さ	顕微鏡イメージング