C. elegans液体毒性アッセイを用いた細菌病原性の評価

要約

出典: Chen, Y. ほか。 カエノラブディティス・エレガンスモデルにおけるエアロモナス感染の病原性と病因の評価。 J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオでは、栄養が限られた液体環境でのミミズの生存率を測定し、細菌の病原性を評価するために用いられる C. elegans のAeromonasを用いた液体毒性アッセイを実演しています。このアッセイは 、C. elegansにおける毒素による損傷の程度と致死率に基づいて株特異的病原性を明らかにしました。

プロトコル

1. C. elegans エアロモナスを用いた液体毒性アッセイ

注: 汚染を避けるために、層流フード内での工程を行うべきです。

1. L1ミミズをENGM(濃縮線虫成長培地)に種まきの翌日、大 腸 菌OP50を広げて4つの エアロモナ ス株と大 腸菌 OP50の各コロニーを1つずつ摘み取り、それぞれ5mLのLBブロスを37°Cで16時間培養します。
   注: プロトコルでは以下の細菌株が使用されました:C. elegansの通常の食物源である E. coli OP50 。A. dhakensis AAK1、初の完全配列決定された臨床病原性 A. dhakensis 分離株。 A. ハイドロフィラ A2-066、 A. veronii A2-007、 A. caviae A2-9307121は国立成功大学病院からの代表的な臨床分離株です。 
   注: 濃縮NGM(ENGM)を1Lの脱イオン水に溶かし、NaCl 3g、細菌ペプトーン5g、酵母抽出物1g、寒天30gを溶かします。121°Cで20分間オートクレーブします。水浴で55°Cまで冷めてから、1 mLの1 M CaCl₂、1 mLの1 M MgSO₄、5%コレステロール1 mLのエタノール、25 mLのリン酸緩衝液を加えます。よく混ざるようにぐるぐる回します。
2. 細菌ブロスの吸収率を_OD600 測定してください。
3. 細菌ブロスを3,500× g で遠心分離し、LBスープを除去します。細菌を再懸浮させ、S培地で細菌ブロスをOD₆₀₀ = 3.0に調整します。S培地に195μLの細菌ブロスを96ウェルプレートの少なくとも8ウェルに加えます。
   注: S培地の組成:S培地を調製するには、使用前に40 mLのS基塩基性塩、0.4 mL 1 Mクエン酸カリウム、0.4 mL微量金属溶液、1 M CaCl₂ 0.12 mL、1 M MgSO₄ 0.12 mL、5%コレステロール40 μL、8 mM FudR1 mLを使用前に混合します。
4. EngmプレートのL4寄生虫はM9培地で大 腸菌 OP5で洗い流します。ワーム溶液を1μLあたり5個のワーム濃度に調整し、96ウェルプレートの各ウェルに5μLのワーム溶液を加えます。1井戸あたり約25匹のワームがあることを確認しましょう。
5. 96ウェルプレートをシェーカーで25°C、200rpmでキュベートします。
6. 24時間、48時間、72時間後に生きているミミズと死んだミミズの数を数えましょう。各井戸の生存率は次の式で計算します:(生きたワーム数/総ワーム数)×100%。
7. 日々のデータ計算で散布図を描きます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シェイカーインキュベーター	イーダー	LM-570R	細菌の培養
NaCl	シグマ	31434	培養培地の調製
MgSO₄	シグマ	M7506	培養培地の調製
寒天	ディフコ	214530	培養培地の調製
CaCl₂	シグマ	C1016	培養培地の調製
コレステロール	シグマ	C8503	培養培地の調製
エタノール	シグマ	32205	培養培地の調製
コー	シグマ	P5958	培養培地の調製
6cmペトリプレート	アルファ・プラス	46	寒天プレート調製
96ウェルプレート	ファルコン	353072	液体アッセイ
細菌ペプトン	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	培養培地の調製
酵母抽出物	シグマ	92144	培養培地の調製
クエン酸•H₂O	シグマ	1909年頃	培養培地の調製
三カリウムクエン酸塩•H₂O	シグマ	104956	培養培地の調製
ファッド・ドリ	シグマ	1271008	培養培地の調製
ジナトリウムEDTA	シグマ	E1644	培養培地の調製
トリプトン	シグマ	16922	培養培地の調製
顕微鏡システム	ニコン	エクリペーズTi逆さ	顕微鏡イメージング
科学用CCDカメラ	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	顕微鏡イメージング