病原性エアロモナス株によるC. elegansの筋肉壊死アッセイ

要約

出典: Chen, Y. ら、 『 Caenorhabditis elegans モデルにおけるエアロモナス感染の病原性と病因の評価』。 J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、病原性のエアロモナス株を用いたC. elegans(Caenorhabditis elegans)の筋肉壊死アッセイを示しています。緑色蛍光タンパク質(GFP)発現の線虫をエアロモナスシードプレートに投与することで、このアッセイは細菌感染をモデル化し、蛍光イメージングを通じて組織損傷を明らかにします。筋肉構造とGFPシグナルの進行性喪失は、エアロモナス誘発性壊死反応を示しています。

プロトコル

1. カエノラブディティス・エレガンス エアロモナスを用いた筋壊死検査

注: 汚染を避けるために、これらの工程は層流フード内で行うべきです。

1. L1ミミズが Escherichia coli OP50を散布した濃縮線虫成長培地(ENGM)に播種された日に、4つの Aeromonas 株と E. coli OP50のそれぞれ1コロニーを採取し、それぞれ2mLのLuria-Bertani(LB)ブロスを37°Cで16時間培養します。注: ここでは以下の菌株を使用しました: 大腸菌 OP50、 C. elegansの通常の食物源。A. dhakensis AAK1、初の完全配列決定された臨床病原性 A. dhakensis 分離株。 A. ハイドロフィラ A2-066、 A. veronii A2-007、 A. caviae A2-9307121は国立成功大学病院の代表的な臨床分離株です。
2. 細菌ブロスの吸収度_OD600 を測定し、LBブロスでOD₆₀₀ =2.0に調整します。6cmの線虫培養培地(NGM)プレートに30μLの細菌ブロスをスポットして広げます。培地を室温で一晩培養してください。
3. L1線虫がL4期に成長する日に、4つの Aeromonas 株または大 腸菌 OP50それぞれをそれぞれ50匹ずつNGMプレートに移します。NGMプレートを20°Cで培養します。24時間ごとに細菌入りの新たに準備されたNGMプレートにミミズを移します。
4. 蛍光顕微鏡を使って筋肉の画像を撮ってください。
   1. スライドの上でランダムに10匹のミミズをM9培地の2%アガロースゲルに置きます。画像撮影前に、アガロース上のM9培地に1%アジドナトリウムを2μL投与して5分未満麻痺させます。
   2. カバースリップを装着し、蛍光顕微鏡(電荷結合デバイスカメラ付き)上の緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルターを使って筋肉画像を撮影します。L4ステージの24時間後、48時間、72時間に筋肉画像を撮影してください。

画像解析と図形準備を画像処理ソフトウェアで行います。
注: スコアの定義と筋肉損傷レベルは 図1に示されており、その基準は以下の通りです:筋繊維欠損に対して3点;筋繊維の断裂または骨折は2ポイント、筋繊維の曲がりには1ポイント、健康な筋繊維は0点です。

結果

図1:エアロモナス感染によるC. elegansの筋肉壊死の対応スコア。筋壊死の基準とそれに対応するスコアは以下の通りです:筋繊維欠損で3点;筋繊維の断裂または骨折は2ポイント、筋繊維の曲がりには1ポイント、健康な筋繊維は0点です。曲がった筋繊維(矢印)、破裂した筋繊維(矢じり)、欠損した筋繊維(星形)が示唆されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シェイカーインキュベーター	イーダー	LM-570R	細菌の培養
K₂HPO₄	J.T.ベイカー	MP021519455	培養培地の調製
KH₂PO₄	J.T.ベイカー	3246-05	培養培地の調製
Na₂HPO₄	J.T.ベイカー	MP021914405	培養培地の調製
NaCl	シグマ	31434	培養培地の調製
MgSO₄	シグマ	M7506	培養培地の調製
寒天	ディフコ	214530	培養培地の調製
CaCl₂	シグマ	C1016	培養培地の調製
コレステロール	シグマ	C8503	培養培地の調製
エタノール	シグマ	32205	培養培地の調製
コー	シグマ	P5958	培養培地の調製
6cmペトリプレート	アルファ・プラス	46	寒天プレートの準備
細菌ペプトン	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	培養培地の調製
酵母抽出物	シグマ	92144	培養培地の調製
クエン酸•H₂O	シグマ	1909年頃	培養培地の調製
三カリウムクエン酸塩•H₂O	シグマ	104956	培養培地の調製
ファッド・ドリ	シグマ	1271008	培養培地の調製
ジナトリウムEDTA	シグマ	E1644	培養培地の調製
FeSO₄·7H₂O	シグマ	215422	培養培地の調製
MnCl₂·4H₂O	シグマ	221279	培養培地の調製
ZnSO₄·7H₂O	シグマ	204986	培養培地の調製
CuSO₄·5H₂O	シグマ	C8027	培養培地の調製
トリプトン	シグマ	16922	培養培地の調製
顕微鏡システム	ニコン	エクリペーズTi逆さ	顕微鏡イメージング
科学用CCDカメラ	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	顕微鏡イメージング