細菌ハイドロゲルパターンのカール繊維媒介安定化

要約

出典:Spiesz, E. M., 他、『Do-it-OWN Bioprinterによる工学的バイオフィルムの三次元パターン化』J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、対照菌株または遺伝子組み換え菌株を含む3Dプリントされたアルギン酸塩パターンを比較する方法を示しています。試験株は誘導時にカール繊維を生成し、アルギン酸ハイドロゲルの構造を強化します。カルシウムキレート溶液による処理後、検査パターンのみがそのまま残り、カーリ繊維生産の安定化効果が強調されます。

プロトコル

1. 3D印刷工程

1. 3Dプリントソフトウェア(Table of Materials)をインストールしてパソコンに開きます。3Dプリンターをコンピューターに接続してください。X軸、Y軸、Z軸のホームボタンをクリックして、プリントヘッドをホーム位置に移動させます。
2. 各プリントごとに、印刷ベッドの特定の場所に準備済みの印刷基材を置きます。
3. プリントヘッドの高さをZ軸でキャリブレーションします。
   1. 手動操作でプリントヘッドを22mmの高さまで上げ、所望の位置に移動する際にペトリ皿の縁に衝突しないようにします。プリントヘッドをプレートの上に置き、ピペットの先端が印刷面に接触するまで下に動かします。このZ軸位置をZ1(印刷面の高さ)として割り当てます。
   2. プリントヘッドを持ち上げ、X軸、Y軸、Z軸で手動操作でプレートエリアの外に移動させます。プリントヘッドとプレート面の作業距離がZ2と定義されている場合、印刷中にZ1 + Z2を印刷プログラムに入力します。
4. 自ら開発した点ごとの座標決定法で、望ましい軌道に従って印刷形状をプログラムします。
   1. 希望する軌道が直線であれば、開始点と終点のみを定義します。曲線線に追加の点を加えると、曲線が滑らかになります。印刷ヘッドを手動で各ポイントに順番に移動させ、それらのポイントの座標を順番に記録します。これらの座標と印刷された各セグメントの印刷ヘッドの移動速度をGコードエディタに入力します。
5. 印刷前後に、プリントヘッドをプレートの端より高く(20mm)持ち上げ、プレート領域から直接外側に移動させます。このプログラムをGコードファイルとして保存し、次の印刷で直接読み込み、新しい印刷基板ごとにZ軸の高さを再測定します。
   注: 正方形印刷の例は表1を参照してください。
6. あらかじめプログラムされたGコードファイルを読み込め。ソフトウェア内のGコードエディタを開き、希望する形状の印刷コマンドをプログラムしてください。各コマンドラインで、プリントヘッドの位置をX軸、Y軸、Z軸で変更できます。すべての印刷ステップでZ値をZ1 + Z2(印刷面の高さ+作業距離)として入力します。
   注: 移動速度も調整可能で、9,000 mm/minは典型的な印刷速度に適した値です。
7. 液体バイオインクをシリンジに詰め、3Dバイオプリンターのシリンジポンプに取り付けます。
8. 印刷ボタンをクリックして、バイオインクを印刷基板に印刷します。
9. 印刷中は、プリントヘッドの動きを完全にソフトウェアで制御します。プリントヘッドが印刷面に触れる前に手動でシリンジポンプを起動してください。
   注: シリンジポンプとプリンターの連携は、押出速度、プリントヘッドが最初の印刷点に移動する速度、およびプリントヘッドの初期位置に基づいて経験的に決定されます。初期プリントヘッド位置が20mmで、プリントヘッド速度が9,000mm/min、押出速度が0.1 mL/hの場合、印刷開始直後にシリンジポンプを起動してください。押出速度を0.1 mL/hから0.3 mL/hに変更した場合、印刷開始後に2−3秒待ってシリンジポンプを起動します。
10. プリントヘッドが最後の印刷地点に到達したら、すぐにシリンジポンプを停止してください。印刷プロセスの終わりにプリントヘッドが持ち上がる前にシリンジポンプを停止してください。そうしないと、余分なバイオインクがプリント基板に落ちて印刷解像度が低下します。
11. 3D構造物の構築については、Gコードエディターでプリントヘッドのすべての動きを制御します。最初の層の印刷高さを入力します。GコードのZ値を2層目で0.2ミリ上げて印刷高さを上げます。その後、より高い層に移動する際にZ値を0.1ミリメートル上げます。印刷中はプレートを動かさないでください。
12. 印刷されたハイドロゲルの幅と高さを測るには、試料の下または隣に鋼製定規を置きます。

2. 大腸菌によるバイオフィルム生産の栽培と効果の検証

1. プリントサンプルを室温で3〜6日間キュベートし、バイオフィルム成分(カーリファイバー)の生成を促します。カメラや蛍光スキャナーを使ってプレートを画像化します。
2. アルギン酸マトリックスを溶解するには、0.5 Mのクエン酸ナトリウム溶液(pH = 7、NaOHで調整)をプリント基板に加え、室温で30 rpmの振って2時間培養します。液体は捨てて、プレートを再度画像化して、シトレート処理前の画像と比較します。

表1:正方形印刷のためのGコードのプログラミングプロセスと説明。

Gコードコマンド	任務
G1 Z20 F9000	Z軸を20mmの高さまで持ち上げ、9,000mm/分の移動速度で調整します。
G1 X95 Y65 F9000	最初のラインのスタート地点まで9,000 mm/分の移動速度で移動します。
G1 Z6 F9000	Z方向に下向きに移動し、適切な(ここではZ=6 mm)の印刷距離にします。
G1 X95 Y105 F300	第一行の終点と第二行の起点。
G1 X135 Y105	2行目の終点と3行目の起点。
G1 X135 Y65	3行目の終点であり4行目の起点です。
G1 X95 Y65	4行目の終点と1行目の起点;正方形が形成されます。
G1 Z20 F9000	Z軸を9,000 mm/分で20 mmの高さまで持ち上げます。
G1 X55 Y40 F9000	ペトリ皿の範囲外の座標(55、40)に移動しましょう。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
LBブロスパウダー	シグマ・オルドリッチ	L3022
軌道シェーカー	VWR	89032-092	モデル3500
ペトリ皿	VWR	25384-326	150 x 15 mm
ラムノーズ	シグマ・オルドリッチ	83650
シリコンチューブ	VWR	デーン 3100103/25
シリンジポンプ	プロセンスB.V.	NE-300
アルギン酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	W201502
シトレートナトリウム単塩基性	シグマ・オルドリッチ	71498
水酸化ナトリウム	VWR	28244.295