蛍光標識細菌における染色体分離のタイムラプスイメージング

要約

出典: Schumacher, D.、Sogaard-Andersen, L. 成長遅い社会細菌 ミクソコッカス・ザンサスの 完全な栄養細胞周期の蛍光生細胞イメージング。ジャーナル・ヴィジョンズ Exp. (2018)

このビデオでは、細菌細胞分裂時に蛍光タグ付き染色体の起源を追跡するためにライブセルイメージングを用いる方法を示しています。タイムラプス位相差顕微鏡法および蛍光顕微鏡を用いて染色体分離の動態を捉えます。

プロトコル

1. 顕微鏡のセットアップとタイムラプス取得

注: ここで説明するプロトコルは、オートフォーカスを備えた逆置広視野顕微鏡、100X/1.30 NAオイルPH3対物レンズ、X・Y軸のモーター付きステージ、sCMOSカメラ、光源、緑蛍光、赤蛍光、黄蛍光タンパク質フィルター、温度制御インキュベーションチャンバー用に開発されました。このチャンバーは細胞を光から守り、一定の温度に保ちます。

1. 顕微鏡観察開始前に、インキュベーションチャンバーと顕微鏡を32°Cで~1〜2時間予熱します。
   注: 顕微鏡のセットアップによっては加熱に時間がかかることがあります。予熱はドリフトを減らし、オートフォーカス制御システムの安定化に不可欠です。
2. 顕微鏡を起動して、顕微鏡制御ソフトを起動します。正しい対物レンズと適切な鏡、フィルターを選択して位相差画像だけでなく、緑蛍光、赤蛍光、黄蛍光タンパク質の画像を取得します。
   注: 顕微鏡には、顕微鏡制御や画像取得用の推奨ソフトウェアが付属することが多いです。ここでは、市販のソフトウェア( 材料表参照)を用いて顕微鏡と画像取得を制御していました。
3. 32°Cで事前に培養された対物レンズとサンプルの底に高品質の浸漬油を一滴加えます。サンプルを顕微鏡ステージに置く際に対物レンズを損傷しないように、物レンズを可能な限り低いZ位置に置きます。金属フレームをサンプルを露出鏡ステージに置き、「穴側」は対物レンズに向けて設置します。サンプルをステージホルダーにしっかり固定します。
4. ステージをZ方向に目標物に近づけてセルに集中します。オイルがサンプルの底面に落ち、対物レンズが接触したら、ステージをゆっくり動かしてください。X/Y方向にステージを動かし、セルが焦点面にあるときに複数の単一セルが見えるまで進めます。後で取得した画像を整列させるために、少なくとも1つの蛍光微小球が視界内に入っていることを確認してください。
   注: 最適な条件下では、視界あたり15〜30セル(2,048×2,048ピクセルまたは133.1×133.1μm)のセル密度に達するべきです。
5. 顕微鏡制御ソフトウェアの多 元取得 ウィザードを開くと、必要に応じて複数の波長やステージ位置で画像を取得するタイムラプス実験を設定できます。
   1. メインタブでタイム ラプス と マルチプルウェーブレンズを有効にしてください。追加のタブはウィンドウの左側に表示されます。
   2. 保存 タブをクリックし 、「 ディレクトリ」を選択して 、取得した画像を保存するためのコンピュータのハードドライブ上の空のフォルダを選択します。 ファイルが存在する場合はインクリメントベース名 を有効にして、連続したデータセットが前のデータセットを上書きしないようにしてください。次に、実験名と日付、株名または実験名を付けます。
   3. タイムラプスのパラメータを調整するには「 タイムラプス 」タブをクリックしてください。 持続時間を 24時間に設定し、 時間間隔を 20分に設定します。 タイムポイントの数 は自動的に変わります。
      注: 最適な時間間隔は、解析対象の実験や細胞機能によって異なります。頻繁な画像取得は光漂白を引き起こすことがあります。したがって、時間的解像度と光漂白の間のトレードオフを経験的に見つける必要があります。4〜6時間の倍増時間であれば、位相差顕微鏡で5分間隔(または希望すればそれより短い間隔)で容易に画像を取得できます。24時間の蛍光顕微鏡検査を望む場合は、画像を約15〜30分間隔で記録する必要があります。
   4. 「 Wavelengths 」タブをクリックしてください。各画像の取得波長数を、各時刻で変えて取得する波長数を選択します。
      注: 各波長ごとに 、「多次元取得」 ウィザードの左側に新しいタブが表示され、波長は上から下へ順に取得されます。各波長ごとに、取得設定は個別に変更可能です。
   5. 一番上から最初の波長タブをクリックします。照明ドロップダウンリストで位相差を選択します。露出は100msを選択し、「取得」ドロップダウンリストで「Every Time Point」を選択してください。ドロップダウンリストで「Not」を選択して自動公開を無効にしてください。
   6. 各時点で取得が必要な波長ごとにステップ3.5.5を繰り返します。ここで説明する実験セットアップおよび蛍光標識タンパク質については、 曝露 パラメータを以下に適用します:mCherry融合タンパク質は250 ms、YFP(黄色蛍光タンパク質)融合タンパク質は200 ms、GFP(緑色蛍光タンパク質)融合タンパク質は1,000 msです。​
      注: 各株および蛍光タンパク質の最適な照明設定は、事前にランプの強度と各波長の画像取得時間を変化させることで決定すべきです。画像取得時間が長すぎると光毒性効果が増大し、最終的には成長停止や細胞死を引き起こします。したがって、画像品質と細胞の生存率の間でトレードオフを取るべきです。
   7. 複数の段階から画像を取得し、同じ実験で記録される細胞数を増やすことができます。
      1. 複数のステージ位置から画像を取得するには、メインタブで「複数段階位置」を有効にしてください。次に「ステージ」タブをクリックし、ライブボタンをクリックして視野を確認できます。
      2. ステージをX/Y方向に動かし、視野内に関心領域(ROI)が入るまで移動させます。ステージタブの「+」をクリックしてX座標とY座標を保存してください。ステージをX方向やY方向に再度動かし、新しいROIが見つかるまで進め、「+」をクリックして座標を再度保存します。希望するリージョン数が確保されるまで続けてください。
         注: 蛍光画像取得の場合、関心領域(ROI)が互いに近すぎないようにして光毒性を最小限に抑えましょう。
6. セルがピント合っているか、保存したXポジションとYポジションをクリックして再度確認し、 AFCホールド を押してハードウェアのオートフォーカスを開始し、実験中保存したZポジションを一定に保ちます。
7. 顕微鏡制御ソフトウェアで「取得」をクリックしてタイムラプス記録を開始します。
   注: 取得した波長ごとに1つのウィンドウが表示され、さらに取得した時間点の数と次の画像取得までの時間を示す追加のウィンドウが表示されます。
8. タイムラプス録画の最初の数点以降もセルがピントが合っているかを確認し、画像の品質を最大化し、必要に応じて再フォーカスしましょう。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AFCでのDMI6000B	ライカマイクロシステム	11888945	自動逆位置広視野蛍光顕微鏡(適応フォーカス制御付き)
ユニバーサルマウントフレーム	ライカマイクロシステム	11532338	異なるサンプルサイズのステージホルダー
HCX PL フルオター 100X/1.30 オイル PH3	ライカマイクロシステム	11506197	位相差対物レンズ
オルカフラッシュ4.0カメラ	浜松	11532952	4.0メガピクセルのsCMOSカメラによる画像取得
フィルターセット TXR ET, k	ライカマイクロシステム	11504170	蛍光フィルターセット、例:560/40 Em:645/75
フィルターセット L5 ET, k	ライカマイクロシステム	11504166	蛍光フィルターセット、例:480/40 Em:527/30
フィルターセット YFP ET, k	ライカマイクロシステム	11504165	蛍光フィルターセット、例:500/20 電磁部:535/30
プロスキャンIII	プライアー	H117N1、V31XYZEF、PS3J100	インタラクティブコントロールセンターを備えた顕微鏡オートメーションコントローラ
EL 6000 光源	ライカマイクロシステム	11504115	外部蛍光光源
インキュベーターBLXブラック	ペコン	11532830	顕微鏡を囲む黒い培養室
Tempcontrol 37-2 デジタル	ライカマイクロシステム	11521719	インキュベーションチャンバーの自動温度制御
Filtropur BT25 0.2ボトルトップフィルター	サーステット	831,822,101	バッファーの滅菌用ボトルトップフィルター
デックグレーザー	VWR	630-1592	ガラスカバースリップ(60 x 22 mm、厚さ:0.7 mm)
Seakem LE アガロース	ロンザ	50004	顕微鏡スライド用のアガロース
ライカ メタモーフ AF	ライカマイクロシステム	11640901	顕微鏡制御ソフトウェアおよび画像解析用ソフトウェア
テトラスペック・マイクロスペア、0.5 μm	サーモフィッシャー	T7281	蛍光微小球