Bdellovibrio bacteriovorusのライブ細胞タイムラプス画像診断 大腸菌に対する捕食

要約

出典: Makowski, Ł. ほか。タイムラプス蛍光顕微鏡を用いた細菌捕食者 Bdellovibrio bacteriovorus の生活環のライブ細胞イメージング。 J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオは、アガロースパッド下で固定された大腸菌を捕食するBdellovibrio bacteriovorusのタイムラプス蛍光画像化を示し、細菌の捕食や宿主-病原体相互作用の研究に用いられる細胞内複製と子孫放出のリアルタイム可視化を可能にします。

プロトコル

1. タイムラプス蛍光顕微鏡の実施

1. 35mmの皿をペトリ皿ホルダーに入れ、実験中に動かないようにします。対物レンズと35mmのアンテナの底に、1滴の浸漬油(屈折率1.518)を置きます。
2. ホルダーを顕微鏡チャンバー内の倒立顕微鏡のステージに取り付けます。
3. 顕微鏡制御ソフトウェアで複数の画像を複数段階で時間をかけて収集するオプションを設定してください。
   1. 倍率(100倍)と多色レンズ(GFP(緑色蛍光タンパク質)/mCherry)をセットします。接眼レンズと明視野(BF)を使って焦点面を見つけてポイントリストマネージャーを開きます。
   2. ステージを移動させ、 Mark point ボタンをクリックして各位置の座標を顕微鏡ソフトに保存することで、少なくとも10の関心のある位置を選択します。光漂白や光毒性を防ぐために、互いに近い位置の位置は避けてください。接眼レンズからモニターにカメラバルブを回し、焦点面を設定して各ポイントをキャリブレーションし、ポイントリストマネージャーの 「ポイント交換 」ボタンをクリックします。
   3. 実験デザイナーを開き、各タブですべての実験パラメータを以下のように設定します:
      1. Zスタッキングボックスのマークを外せ。
      2. 蛍光チャンネルを選択し、最適な照明設定を設定してください。ここでは以下の設定が使用されました:mCherryチャンネル用、mCherryフィルターセット(EX575/25;EM625/45)、50%の強度、200msの露光時間、GFPチャネルにはGFPフィルターセット(EX475/28;EM525/48)、50%の強度、80ms;BF画像ではPOLチャネル、5%の強度、50msです。
      3. 画像取得と実験の総時間の間に一定間隔を選びます。ここでは、実験の10時間にわたり5分間の間隔で実施されました。
      4. 選択したポジションのフォーカス維持を有効にしてください(ここで使用しているシステムでは、「 UltimateFocusでフォーカスを維持する 」チェックボックスにマークを付けてください)。
      5. 画像ファイルを自動的に保存するデータフォルダを選択します。
      6. 顕微鏡のソフトウェアコントロールで全設定を再確認し、タイムラプス実験を開始してください。
4. 実験の最初の1時間が過ぎた後、すべてのステージ位置がピントが合っているか確認してください。必要に応じて画像取得の間の時間間隔でフォーカスを調整してください。
5. タイムラプス実験が終わったら、ペトリ皿を取り外し、バイオセーフティプロトコルに従い35mm皿とアガロースパッドを使用します。
   注: ステップ1.2以降のすべてのサブステップはDeltaVision Eliteユーザー専用です。他のシステムを使う研究者は、個々のシステムに応じて設定を調整する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
認定分子生物学アガロース	バイオ・ラッド	161-3100	アガロースパッド用の低蛍光アガロース
フィジー	イメージJ	https://imagej.net/Fiji	オープンソース画像処理パッケージ
ガラス底盤 35mm	イビディ	81218-200	コーティングされていないガラス
顕微鏡	GE	デルタビジョン・エリート	マイクロタイターステージ、究極フォーカスレーザーモジュール、DV Elite CoolSnap HQ2カメラ、SSIアセンブリFP DV、キットオブジェ。Oly 100x オイル 1.4 NA、プリズム Nomarski 100x LWD DIC、ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
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