蛍光イメージングによる細菌タンパク質分布の三次元可視化

Abstract

出典: Bratton, B. P., 他、『 細菌細胞の三次元イメージングによる正確な細胞表象とタンパク質局在化のための研究』。 J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオは、細菌細胞の三次元蛍光画像を取得し解析し、単一細胞レベルでのタンパク質組織を研究する方法を示しています。

Protocol

1. イメージング

1. 密封されたスライドを顕微鏡に挿入し、周囲の温度と温度を均衡させるために5分間置きます。顕微鏡室は試料準備室とは異なる温度にある場合があります。
2. サンプルの蛍光Zスタックを取ります。
   注: zスタックは被写界深度より小さいz間隔でサンプル全体を覆うべきです。1.45 NA 100x対物レンズ、厚さ約1μmの 大腸菌 細胞の場合、100 nmの40ステップで十分に機能します。より大きなセルや表面に完全に平らに置かれないセルでは、50歩以上の工程が必要になることがあります。十分な工程を含め、サンプルの上下が完全にぼかされていることを確認してください。
   1. 顕微鏡に関連するソフトウェア( 材料表参照)を使って顕微鏡を制御してください。
   2. 顕微鏡のフォーカスホイールを使って細胞の中央にピントを合わせます。ND取得の項目でZボックスにチェックを入れてzスタックを取得してください。ホームボタンをクリックして、セルの中央をスタートポイントに設定します。ステップサイズを0.1 μmに設定し、レンジを4 μmに設定します。Zデバイスが圧電段に設定されていることを確認してください。
   3. ラムダウィンドウの下の蛍光チャンネルを、画像化する蛍光分子の設定に設定します。この実験ではGFPとmCherryが使用されました。
      注: 追加の蛍光チャンネルの3D分布を求める場合は、同じステップサイズとレンジを持つ追加のZスタックを第2色チャンネルに取ります。この実験では、細胞質のmCherryを用いて細胞形を決定し、MreB-GFPを第二のカラーチャネルとして用いました。
   4. 実験の順序がλ(z系列)に設定され、切り替え前に各カラーチャンネルで完全なZスタックを取るようにしてください。
   5. 画像取得を開始するには「今すぐ実行」をクリックして、一方または両方のZスタックが完成したらファイルを保存します。
   6. パッドの新しいエリアに移動し、ステップ1.2.2-1.2.5を繰り返します。

2. 細胞再構成

1. 個々のセルをトリミングし、画像をスタックされたtiffファイルとして保存し、ファイルごとにセルが1つだけになるようにします。このセルが他のセルから十分に隔離されていること(すなわち、xyのぼかし関数の全幅半最大値の約5倍)であることを確認しましょう。
   注: これは無料で入手可能な画像解析ソフトウェア( 材料表参照)を用いて行うことができます。
   1. 個々のセルの周りにボックスを描き、そのセルを2回、各チャンネルごとに1回ずつ複製します。重複ハイパースタックボックスにチェックを入れ、チャネルを1か2に変更し、スライスにzスタック全体を含めるようにしてください。
      注: 細胞の形状のみを撮影し、追加の蛍光タンパク質を検出しない場合、チャネルは1つだけ存在します。
   2. 両方のスタックが利用可能になったら、画像 |スタック |ツール |まずタンパク質チャネルと、次に形状チャネルとの画像を組み合わせます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アガロース	シグマ・オルドリッチ	A9539
綿棒	ピューリタン・メディカル・プロダクツ・カンパニーLLC	S304659	VaLaPのAppyに使われていました
カバースリップ	VWR	16004-302
フィジー	イメージJ	https://fiji.sc	クロセルに使われる
ラノリン	シグマ・オルドリッチ	L7387	パラフィンやワセリンと組み合わせてVaLaPを作る
LB成長培地	BDディフコ	DF0446173
M63中型	米国生物学	M1015
MATLAB	数学作品		畳み込みスクリプトを前進させる必要がありました
顕微鏡スライド	フィッシャー	12-550-133
NIS要素	ンコン
パラフィン	シグマ・オルドリッチ	327212
ワトロリンゼリー	等しい	49035-038-27
ピエゾZステージ	ニコン	77011589
ピペットの先端 -p200	USAサイエンティフィック	1111-0730
ピペットチップ - p10	USAサイエンティフィック	1111-3730