ビブリオ・コレラ菌に感染したゼブラフィッシュの腸内細菌負荷の定量化

要約

出典: Nag, D.ら 。 成体ゼブラフィッシュモデルにおけるビブリオ・コレラ菌の定着と下痢の定量化。 J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、抗生物質耐性菌ビ ブリオ・コレラ菌株に感染した成体のゼブラフィッシュにおける腸内細菌負荷を定量化するプロトコルを示しています。安楽死と解離の後、腸管は分離され、ガラスビーズで均質化され、細菌を放出するために処理されます。得られたホモジネートは選択培地にプレートされ、β-ガラクトシダーゼを発現する青色のコロニーを数えて細菌負荷を推定します。

プロトコル

1. 腸内定着レベルの測定

注: 腸内定着はゼブラフィッシュモデルにおいて最も有用な指標であり、さまざまなコレラ菌株の相対的な適応度や変異、遺伝子ノックアウトの影響を比較するために用いられます。

1. 安楽死

1. 実験が望ましい終点に達したら、感染水(通常15mLで十分)を採取し、排泄細菌数や下痢(粘液分析、タンパク質含有量、ODなど)の測定を行います。

2. 残りの水を魚網を通して漂白剤に注ぎ、水中のコレラ菌を殺します。

3. 魚を感染水と336μg/mLのエチル3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸(トリカイン)を入れたビーカーに入れ、このトリカイン溶液で20分間RTで孵化させます。
注:フィッシュネットは10%の漂白剤溶液で滅菌されています。

2. 解剖

1. 魚の調理

1. 使い捨てのプラスチックスプーンでトリカイン溶液から魚をすくい取り、解剖面に置きます。

2. 魚の腹部を上に向けて位置づけ、下顎にピンで固定します。ピンの鈍い端は体の中心から離れて角度をつけます。肛門のすぐ後ろ、体から離れた角度でもう一本ピンを差します。

2. 腸管の露出

1. 70%エタノールに浸した綿毛のないワイプで魚の腹面を綿棒で拭きます。

2. メスとヴァナスハサミを70%エタノールに浸して火をつけて滅菌する。

3. 鱗を貫通し、メスを使って腹部の皮膚のすぐ下に縦方向に小さな切開をします。腸管は皮膚のすぐ下にあるため、深く切りすぎないように注意してください。

4. ハサミを使って、切開を体の長さに沿って慎重に伸ばし、皮膚の高さ以上に切らず、肛門は避けます。

5. はさみで魚の頭に向かって横に2回切り、切開口を開きます。

6. 側面切開の両側の皮膚を解剖面にピンで固定し、ピンを体から離して外側に傾けます。

注: ピンの先端は以前にアルコールで炎をつけて滅菌されていました。

3. 腸管の切除

注: 腸道は他の臓器の上に薄く細い管状で見えるべきです。

1. 鉗子を炎で滅菌し、その後腸全体(通常12〜15mmの長さ)を除去します。腸をガラスビーズ(ステップ 1.3.1–1.3.2参照)と1xPBSまたはLB1mLを氷に入れた均質化チューブに入れます。

3. 均質化

1. 均質チューブを事前に準備し、1.5gの1mmガラスビーズを2mLのスクリューキャップチューブに注ぎ込み(約半分まで充填)、その後オートクレーブで滅菌します。

2. 滅菌LBを1mLまたはPBSを1x添加します。

3. ゼブラフィッシュの腸がチューブに追加されたら(ステップ 1.2.3.1)、キャップをしっかりとねじ込み、チューブをボルテックスホモジナイザーに固定します。

4. 最大設定で1分間均質化し、その後氷で1〜2分間冷却します。この均質化サイクルをもう一度繰り返し、完全な均質化を実現します。注:均質化のためのいくつかの代替方法も有効です。

4. 腸内定着レベルの定量化

1. ホモジネートの連続希釈用に、各チューブに900μLのLBまたは1倍のPBSを加えて、小型ガラス試験管または1.5mLマイクロ遠心分離機チューブを準備します。魚ごとに5〜6本のチューブを準備し、腸ホモジネートを10倍に連続希釈します。最初のチューブに100μLのホモジネートを加え、渦を巻き起こして混合し、その後1チューブから2番目のチューブに100μLを加えます。

2. すべての希釈が準備されるまでこの手順を繰り返します。

3. LB寒天プレートに各希釈物100–200μLをプレートし、ストレプトマイシン耐性株を使用した場合は100μg/mLのストレプトマイシンと40μg/mLのXガロン(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)を含みます。プレートを30°Cで16〜18時間孵化します。

4. 一晩の孵化後、自動コロニーカウンターまたは手動でコロニー数えてプレート上のコレラ菌群を数えます。カウントされたコロニーをマーカーチップで印をつけると役立ちます。

5. プレートカウントに懸濁液の希釈係数を掛け、メッキされた体積を考慮して魚の腸あたりのCFUを算出します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
楽器
シェイカーインキュベーター	ニューブランズウィック・サイエンティフィック、エジソン、NJ	エクセルラ E25
インキュベーター	ミネソタ州プリマス、ヌエア	オートフロー
分光光度計	サーモ、ウォルサム、マサチューセッツ州	ギアシス6
渦ホモジナイザー	ミニビードビーター24	112011
計量機	オハウス、コロンビア、メリーランド州	アドベンチャラープロ
ヒートスターター	コーニング、コーニング、ニューヨーク州	PC-420D
バーナー
自動コロニーカウンター	REVSCI	120417B
材料
400mlガラスビーカー	パイレックス
穴あき蓋	チップボックスから穴が開いたマイクロチップホルダー
使い捨てプラスチックスプーン	オフィスデポ、ボカラトン、フロリダ州	D15-25-7008
魚槽システム	アクアニアリング、サンディエゴ、カリフォルニア州
RO浄水器	アクアFX	TK001
魚網	マリーナ
魚の餌	テトラフィン
ブラインシュリンプ	レッドジャングルブランド	O.S.I. プロ80
発泡スチロールボード
ピン
メス	ファインサイエンティフィックツールズ、フォスターシティ、カリフォルニア州	10000-10
鉗子	ファインサイエンティフィックツールズ、フォスターシティ、カリフォルニア州	11223-20
ヴァンナスハサミ	ファインサイエンティフィックツールズ、フォスターシティ、カリフォルニア州	15000-11
2mlスクリューキャップチューブ	フィッシャー・サイエンティフィック、ハンプトン、ニューハンプシャー州	02-681-375
1mmガラスビーズ	バイオスペック	11079110
広げるためのガラスビーズ	シグマ、セントルイス、ミズーリ州	18406-500G
ペトリプレート	フィッシャー・ブランド、ハンプトン、NH	FB0875713
1.5 ml遠心分離機チューブ	ミッドサイ、バレーパーク、ミズーリ州	AVSS1700
50ml遠心分離機チューブ	コーニング・ファルコン、コーニング、ニューヨーク州	352098
試験管	パイレックス	9820
ガラスピペット	フィッシャー・ブランド、ハンプトン、NH	13675K
マイクロピペット	サルトリウス・バイオヒット、ゲッティンゲン、ドイツ	M1000/M200/M20
ヒント	ジェネシー・サイエンティフィック、サンディエゴ、カリフォルニア州	24-150RS/24-412
化学物質
インスタントオーシャンソルト
リン酸塩緩衝塩水	VWRライフサイエンス、ラドナー、ペンシルベニア州	K813-500ml
トリカイン(エチル3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸塩	シグマ、セントルイス、ミズーリ州	A5040
LBミディアム
NaCl	フィッシャー・サイエンティフィック、ハンプトン、ニューハンプシャー州	BP358-212
寒天	BDバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州	214010
TCBSアガー	BDバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州	265020
DCLSアガー	シグマ、セントルイス、ミズーリ州	70135-500gm
ソフトウェア
マイクロソフトオフィス
プリズム5