成虫ゼブラフィッシュにおける ビブリオ・コレラ菌 による腸内定着と下痢誘発

要約

出典: ナグ, D., et.al. 成体ゼブラフィッシュモデルにおける ビブリオ・コレラ菌 の定着と下痢の定量化。 J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、成体ゼブラフィッシュに病原性 のビブリオ・コレラ 菌株を接種し、腸内の定着と疾患の転帰を研究する様子を示しています。細菌毒素が腸の健全性を乱し、液体の漏れ、粘液分泌、水性下痢を引き起こし、魚がさらなる分析のために準備されるまでの過程を示しています。

プロトコル

1. ゼブラフィッシュの浸水による予防接種
   注: この曝露方法は感染の自然な経過に似ています。
   1. コレラビブリオの調製
      1. 溶原ブロス(LB)5mLにLBプレートから分離された V. cholerae コロニーを接種し、37°Cで振って180rpm、6〜8時間(一晩培養)培養します。
      2. 250 mLの円錐形フラスコに新鮮なオートクレーブLB培地25 mLを、上記の50 μLの一晩培養液を接種します。振って37°C(150rpm)で16〜18時間孵化します。
      3. 1/10希釈した1/10の光学密度(OD₆₀₀)を600 nm(OD 600)で読み取り、1mLあたりの細菌数を推定します(OD₆₀₀ = 1は~10⁹ CFU/mLです)。
      4. 細胞は6,000gの遠心分離で10分間採取します。培地はピペットで取り出すか、消毒液に注ぎます。細胞を無菌PBS中に再懸濁し、通常は1 x 10⁷ から1 x 10^{10 10 10} mLあたりの濃度で調整します。
         注: ここでは、60 mg/Lの海塩を含む逆浸透圧水を無菌感染水と呼びます。
   2. 接種と抱卵
      1. 400mLのビーカーに4匹か5匹のゼブラフィッシュを入れ、200mLの無菌感染水を入れます。
      2. 200mLの感染水に1mLのV . cholerae を加え、所望の感染濃度(通常5 x 10、⁴ 〜5 x 10、⁷ CFU/mL)を得ます。
      3. 魚が飛び出さないように、ビカーに穴あきの蓋をかぶせます。200μLのチップボックスの上部がこれに適しています。
      4. 各ビーカーにラベルを貼り、実験期間中はガラス前面のインキュベーターに28°Cで設置します。
   3. 一過曝露の手順
      注: 通常6時間の一時的なコ レラ菌 曝露と接種細菌の除去は、伝播の研究や排泄細菌のより正確な定量化に役立ちます。
      1. 6時間ほど浸したら、魚網にかけてビーカーの水を流し、魚を集めます。感染した水を漂白剤の容器に捨てて、 コレラ菌を殺します。
      2. 取り出した魚を200mLの無菌感染水のビーカーに入れます。魚をこの清水で5分間泳がせて、表層の細菌を除去します。
      3. 網の手順を繰り返し、魚を200mLの滅菌感染水を入れた新しいビーカーに入れます。実験の間、魚はこのビーカーに入れておきましょう。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
楽器
インキュベーター	ミネソタ州プリマス、ヌエア	オートフロー
材料
400mlガラスビーカー	パイレックス
穴あき蓋	チップボックスから穴が開いたマイクロチップホルダー
魚槽システム	アクアニアリング、サンディエゴ、カリフォルニア州
RO浄水器	アクアFX	TK001
魚網	マリーナ
魚の餌	テトラフィン
ペトリプレート	フィッシャー・ブランド、ハンプトン、NH	FB0875713
1.5 ml遠心分離機チューブ	ミッドサイ、バレーパーク、ミズーリ州	AVSS1700
試験管	パイレックス	9820
マイクロピペット	サルトリウス・バイオヒット、ゲッティンゲン、ドイツ	M1000/M200/M20
ヒント	ジェネシー・サイエンティフィック、サンディエゴ、カリフォルニア州	24-150RS/24-412
LBミディアム
トリプトン	BDバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州	211705
酵母抽出物	BDバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州	212750
NaCl	フィッシャー・サイエンティフィック、ハンプトン、ニューハンプシャー州	BP358-212
寒天	BDバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州	214010