細菌曝露後の C. elegans における腸の透過性評価

要約

出典: Le, T. A. N. , ほか、『カ エノルハブディティス・エレガンスの腸内透過性に対する細菌および化学物質の影響の測定』。 J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、Pseudomonas aeruginosaに曝露されたC. elegansの腸の透過性を定量化するための蛍光ベースのアッセイを示しています。大腸菌を与えた対照群と比較して、病原体処理された寄生虫は体腔への蛍光色の漏れが増加し、上皮バリアの損傷を示しています。

プロトコル

1. 線虫成長培地(NGM)プレートの準備:さまざまな細菌がCaenorhabditis elegans(C. elegans)の腸内透過性に与える影響を試験するため

1. 500mLのガラス瓶にペプトーン1.25g、NaCl1.5g、寒天8.5g、磁気攪拌器、蒸留水487.5mLを入れます。
2. 混合物をよく混ぜ、121°Cで15分間高温滅菌し、その後55°Cの水浴で30分間冷ます。
3. 培地を水浴から取り出し、成分(1 M CaCl₂ 0.5 mL、コレステロール 0.5 mL、MgSO₄ 0.5 mL、KPO₄ 12.5 mL)をNGMに加え、よく混ぜます。
   注: コレステロール(絶対エタノールに溶解)を除くすべての個々の成分はオートクレーブされなければならず、すべての実験工程はクリーンなベンチ上で行われなければなりません。
4. 各90×15mmのペトリ皿に20mLのNGMを分散し、寒天を室温(約20°C)のクリーンベンチで固化させます。NGMプレートは4°Cで最大1か月間保存可能です。
   注: ここでプロトコルを一時停止できます。FITCデキストラン(フルオレセインイソチオシアネートデキストラン)染色に用いられたNGMプレートが準備されました。各60×15mmのペトリ皿に10mLのNGMを配布し、室温(約20°C)のクリーンベンチで固化させました。
5. 4°Cの冷蔵庫から細菌培養液を取り出し、培養液を十分にボルテックスしてからNGMプレートに広げます。
6. 新しいNGMプレートに合計800μLの細菌培養液を加え、20°Cのインキュベーターで一晩乾燥させます。
   注: 最初の実験(図1)では、大 腸菌 OP50を含むNGMプレート2枚、 P. aeruginosa PAO1を含むNGMプレート1枚、E . faecalis KCTC3206を含むNGMプレート1枚を準備しました。2回目の実験(図2)では、生の大 腸菌 OP50を含むNGMプレート2枚、生き たP. aeruginosa PAO1を含むNGMプレート1枚、熱不活化P . aeruginosa PAO1を含むNGMプレート1枚を準備しました。

3. 年齢同期したC. elegansの調製

1. 固体NGMプレート上でミミズを培養し、大 腸菌 OP50で餌を与えて望む個体群に達するまで続けます。
2. 卵を同期させるには、タイミングを合わせた産卵法か漂白液処理を用いてください

4. 細菌の治療とFITCデキストラン摂食

1. 年齢同期卵はNGMプレート上で64時間、生大 腸菌 OP50を栄養補助で孵化します。
2. 年齢同期したL4幼虫をSバッファーで洗浄し、約500匹以上の線虫を異なる細菌や化学物質を含む処理用NGMプレートに移します。20°Cで48時間孵化します。
   注: 使用される細菌や化学物質によって、治療時間は24時間から72時間の範囲で行われます。DIMの治療効果や予防効果は、病原体で線蟲を前処理し、その後DIMで治療(治療効果)を施すか、前処理をしてから病原体で治療(予防効果)することで評価できます。
3. FITCデキストラン補足プレートを準備するには、熱不活化E . coli OP50 2 mLとFITCデキストラン4 mgを混合します。次に、FITCデキストランと大 腸菌 OP50の混合物100μLを20枚の新しいNGM寒天プレート(60 mm x 15 mm)に分け、きれいなベンチで1時間乾燥させます。
   注: 各NGMプレートにおける最終濃度は20 μg/mLとなります。
4. FITCデキストランを含まない大 腸菌 OP50含有NGMプレートを5枚準備し、車両制御治療用に準備します。この目的のために、100μLの熱不活化 大腸菌 OP50を各新鮮なNGM寒天培地(60mm x 15mm)に分け、プレートを清潔なベンチで1時間乾燥させます。
   注: 各独立実験には、FITCデキストラン補足NGMプレート15枚とFITCデキストランなしNGMプレート5枚が必要です。
5. 処理48時間後(ステップ7.2以降)、Sバッファーでミミズを洗浄し、FITCデキストラン補給プレートおよびFITCデキストランなしのNGMプレートに移し、プレートを一晩(14〜15時間)培養します。
   注: 各処理群に対して、FITCデキストラ染色(または車両制御給餌)の5回の複製が必要です。
6. ミミズをSバッファーで洗い、新鮮なNGM寒天プレートに1時間這い回らせます。
   注: 各独立実験には合計20枚の新しいNGMプレートが必要です。この段階では、NGMプレートを大 腸菌 OP50の有無にかかわらず補助的に使用できます。
7. 黒い96ウェル平底板の各ウェルに4%ホルムアルデヒド溶液50μLを加えます。各NGMプレートから約50個のワームを各ウェルに移し、蛍光測定を行います。1〜2分後に各ウェルからホルムアルデヒドを徹底的に除去し、ウェル全体をコーティングするために100μLのマウントメディウムを加えます。
   注: ホルムマルデヒド溶液(4%)がミミズを固定・固定するために使われます。各処理群に対して、画像解析のために5つのウェル(5回の複製)が使用されます。

5. オペレッタイメージングシステムを用いたC. elegansのイメージングおよびFITCデキストラン蛍光取り込みによる腸の透過性の決定

注: 蛍光立体顕微鏡はオペレッタシステムの代わりに画像解析に使用できます。

1. Operetta高成分イメージングシステムを使って蛍光画像を撮影し、蛍光強度を測定し、Harmonyソフトウェアで画像を解析します。
2. Harmonyソフトウェアで「 Open Lid 」アイコンを押すと蓋が開き、プレートを機械に入れます。
3. パラメータを設定しましょう。
4. 「 セットアップ」をクリックし、プレートタイプ(96ウェルのCorningフラットボトム)を選択し、チャンネル(明視野チャンネルとEGFPチャンネル)を追加します。
5. レイアウトを調整してください。レイアウト 選択に行き、「 Track 」を選択し、パラメータを調整してください(最初の写真は1μm、平面数は10、距離は1μm)。
6. 処理井戸のうち1つとキャプチャフィールドを選び、「 テスト 」を押して「 実行」実験 セクションで画像が満足できるか確認してください。
7. 画像が満足のいく場合は、「 セットアップ 」セクションに戻り、画面の最後に 「リセット 」アイコンを押してください。次に、すべてのターゲット井戸と適切な数のキャプチャフィールドを選択します。
8. 再度 「実験を実行する 」に行き、プレート名を入力してから 「スタート 」を押して処理を開始します。
9. 蛍光の強度を測定するには、画像解析セクションに行き画像を入力してください。EGFP(強化グリーン蛍光タンパク質)チャネルと方法Bを選択して細胞を見つけてください。共通閾値を0.5、面積を>200μm^²に、スプリットファクターを3.0に、個別閾値を0.18、コントラストを0.18以上に調整します。次に強度の性質を計算し、平均を出力として選びます。セットアップを保存するには 「適用」 アイコンを押してください。
10. 評価 セクションに 行き、ヒートマップとデータ表を入手して強度を測定してください。 読み取りパラメータ をセル — 強度セル EGFP 平均 — 井戸あたり平均 に設定し、評価を開始します。
    注: ここでプロトコルを一時停止できます。
11. オペレッタからデータを抽出するには、「 設定 」ボタンをクリックし、 データ管理を選択してください。
12. 「アーカイブを書き込む」を選択し、ブラウズを開いてファイルを選択します。
13. ファイルを選択するには、左隅の小さな + 信号をクリックし、その後 「測定 」をクリックして プレート名を選択してください。
14. ファイルを選択して OKをクリックします。
15. アクティブなパスの「 ブラウズ 」信号をクリックしてファイルを保存するパスを選択します。
16. データファイルを保存するには 「スタート 」をクリックしてください。
    注: ここでプロトコルを一時停止できます。

結果

図1:異なる細菌がC. elegansの腸内透過性に与える影響。明視野、FITC蛍光(緑チャネル)、統合画像を含むミミズの顕微鏡画像。(A) FITCデキストラ摂食なしの大腸菌OP50、(B) FITCデキストラ摂食の大腸菌、(C) FITCデキストラ摂食のP. aeruginosa PA...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
90×15mmペトリ皿	SPLライフサイエンス、韓国	10090
60×15mmペトリ皿	SPLライフサイエンス、韓国	10060
バクター・アガー	ベックトン・ディキンソン	参考番号214010
ホルムアルデヒド溶液	シグマ	F1635
脳心臓注入(BHI)	ベクトン・ディキンソン	参考番号237500
カエノラブディティス・エレガンス N2	カエノラブディティス遺伝学センター(CGC)		野生型
コスタアッセイプレート、96ウェルブラック、透明で平らな底、未処理、蓋なしの発泡スチロール	コーニング・インコーポレイテッド	参考文献3631
大腸菌OP50	カエノラブディティス遺伝学センター(CGC)
フルオレセイン・イソチオシアネート - デキストラン	シグマ	FD10
ハーモニーソフトウェア	パーキンエルマー		ヴェルソン 3.5
ルリア・ベルターニLBミディアム	メルク	VM743185 626 1.10285.5000
硫酸マグネシウム・ヘプタハイドレート	フィッシャー・バイオリエージェント	BP2213-1
フルオロマウント水性マウンティングメディウム	シグマ	F4680
オペレッタCLS高内容解析システム	パーキンエルマー	HH16000000
ペプトン	メルク	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	韓国のタイプ文化コレクション	KCTC第1637号
塩化ナトリウム	フィッシャー・バイオリエージェント	BP358-1
立体顕微鏡	ニコン、日本	SMZ800N
酵母抽出物	ベクトン・ディキンソン	参考番号212750