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動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. マウスの口腔ガベジ用サルモネラ・チフィムリウムΔAroA培養の調製
- S. Typhimurium ΔAroAの凍結グリセロールストックから、100 μg/mLのストレプトマイシンを含むLuria-Bertani寒天(LB寒天)を用いてストリークプレートを作成し、無菌接種ループを設置します。37°Cで一晩培養します。ストリークプレートは4°Cで最大1週間保存可能です。
- 感染の前日に、2.5mLの水に溶かして0.5gのストレプトマイシンを準備します。ストレプトマイシン溶液をろ過滅菌した後、バルブチップ付きの22Gガベージ針と1 mLの注射器、100 μLのストレプトマイシン溶液(1回あたり20 mg ストレプトマイシン)を使ってマウスを経口ガベージします。接種ループを用いて、1コロニーの培養管にLBブロス3mL(50 μg/mLストレプトマイシン)を接種します。37°Cで200回転毎分(RPM)で振動しながら、一晩好気培養を行ってください。
- 感染当日には、無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回連続して1/10希釈した サルモネラ 菌培養を行い、最終感染用投与を準備します。これにより、約3×106コロニー形成ユニット(CFU)を含む100μLの接種点が得られます。
- バルブ型の22Gガベージ針と1mLの注射器を使い、各マウスに準備済みサルモネラ菌100μLをガベージします。
注: 無菌技術を用いて サルモネラ 菌培養を準備します。最終接種時のサ ルモネラ 濃度は、LB寒天に連続希釈剤をストレプトマイシンでプレートすることで確認できます。
2. 組織中のサルモネラ負荷の評価
- 2 mLのセーフロック式丸底マイクロチューブに、1 mLの滅菌PBSとオートクレーブされたステンレス製ビーズを準備します。組織採取前にチューブの重さを事前に測定してください。
- 二酸化炭素曝露で安楽死したマウスの大腸と脾臓組織を切除します。個々の動物から組織を別々のチューブで採取してください。チューブの重さを測って組織の重さを判断してください。
- ミキサーミル装置を用いて30Hzで15分間均質化。96ウェルの2 mLメガブロックに1ウェルあたり900μLのPBSを移します。最初のウェルに100μLの組織均質液をピペットで注入し、混合し、100μLを次のウェルに追加して連続希釈を行い、10⁻⁶の希釈が得られるまで続けます。各希釈物を10μL、三重酸塩で100μLのストレプトマイシンを含むLB寒天にプレートします。
- 1000μLサンプルのうち10μLをメッキし、適切な希釈係数を適用したため、平均CFUを100倍でカウント・掛けました。組織重量の総CFUを組織重量で割って、組織1グラムあたりのCFUを算出します。
注: 組織処理中はすべてのサンプルを氷または4°Cで保管してください。組織均質物質を用いた連続希釈を行う際は、広口ピペットの先端を使用してください。PBSを含む96ウェルのメガブロックを事前に準備してください。