マウス共感染モデルにおける細菌列挙のための感染組織処理

Abstract

出典: Lenhard, A., 他 ウイルス共感染による肺炎連鎖 球 菌の感染者から病原体への移行をマウスモデルで示すものは、加齢による悪化疾患を再現しています。 J. Vis. Exp. (2022年)

このビデオは、病原性細菌とウイルスに同時に感染したマウスの肺の処理を実演しています。肺組織のミンチ、均質化、プレート化により、細菌量を定量化し、肺への細菌の拡散や疾患の重症度を示します。

Protocol

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 細菌の個体数を目的とした感染組織の処理

1. 肺採取
   1. 解剖ハサミを使って露出した肋骨の側面に切り込みを入れ、肋骨をマウスの頭部に向かって優しく引き上げて心臓を露出させます。25Gの針をリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)が入った10mLの注射器に取り付け、右心室に挿入し、ゆっくりと灌注を開始します。肺の漂白が成功しているかどうかを確認してください。肺組織を壊さないようにゆっくりと流してください。
   2. 鉗子で心臓を持ち上げ、肺と心臓を分けるために切開します。分離後は、鉗子で肺のすべての葉を採取し、無菌PBSで洗い流して残留血液を除去します。ペトリ皿で、肺を小さく刻んでよく混ぜます。細菌コロニー形成ユニット(CFU)またはウイルスプラーク形成ユニット(PFU)を決定するために肺ミックスの半分を取り出し、均質化のために0.5mLのPBSを充填した丸底15mLのチューブに入れます。
      注: 異なる評価で同じ肺の異なる葉を取ることは避けることが重要です。代わりに、すべての葉片を細かく刻み、よく混ぜ合わせて、異なる評価のために均等に分けるべきです。
2. 採取した組織を均質化するには、まずホモジナイザープローブを70%エタノールに浸し、ホモジナイザーを60%の出力で30秒間作動させます。この手順を無菌水で10秒繰り返します。各組織を1分間均質化します。各サンプル間と、各臓器とサンプルグループの間に70%エタノールの新しいチューブでホモジナイザープローブを洗浄します。
3. 細菌数の列挙
   1. すべての臓器が採取され均質化されたら、血液寒天プレートに連続希釈をプレートします。総CFUを計算するには、10μLを用いてプレートを塗り、各サンプルの最終体積(mL)を記録します。37°C(5%_CO2)で一晩培養します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD使い捨て注射器(Luer-Lokチップ付き)(1mL)	フィッシャー	14-823-30
フィッシャーブランド繊細解剖ハサミ	フィッシャー	08-951-5	収穫に使われる器具
フィッシャーブランドの組織鉗子解離	フィッシャー	13-812-38	収穫用の鉗子
フィッシャーブランドの単回使用滅菌注射器(10 mL)	フィッシャー	14-955-459