宿主と病原体の相互作用を研究するためのバリア機能を持つヒトコロノイド単層の生成

要約

出典:J. G. 他病原体、共生体、宿主腸上皮間の相互作用を研究するためのヒトコロノイドモノレイヤー。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、コラーゲン被覆のTranswellシステム上で大腸由来の上皮細胞を培養し、腸の関門をモデル化し宿主と病原体間の相互作用研究を可能にする粘液生成単層を生成する手順を示しています。

プロトコル

1. 腸状液/大腸液懸液の板付け

1. コーティングされた挿入物を4°Cで保存した場合、細胞プレートの少なくとも30分前に37°C/5%_CO2 組織培養インキュベーターで平衡状態に保たれます。
2. 各インサートをメッキリングする際、1 mLの温かい(25〜37°C間)膨張液(EM)を準備し、10 μM Y-27632と10 μM CHIR 99021を加えます。
   注: EMは、Advanced DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)/F12(B27含有1x)、50% WNT3A調理培地、15% RSPO1調理培地、10%Noggin調理培地、50 ng/mLヒトEGF(表皮成長因子)、500 nM A-83-01、10 μM SB 202190、抗生物質/抗菌薬カクテル(1x)、10 mM HEPES(N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸))で構成されています。 L-アラニル-L-グルタミン二ペプチド(1x)、およびペニシリン-ストレプトマイシン(1x)( 材料表参照)。
3. 細胞ペレットを含むチューブから洗浄培地を吸引し、少なくとも100μL/インサートが得られるほどのEM液で再懸濁します。
4. 各インサートからコラーゲンIV溶液を吸引し、150μLのウォッシュメディウムで2回洗います。
5. 各インサートの下の空間に600μLの電磁波をピペットで注ぎます。
6. 各インサートに100μLの細胞懸濁液をピペットで注ぎます。
7. プレートを組織培養インキュベーターに戻し、少なくとも12時間はそのまま放置してください。
   注: 大腸板を揺らしたり急に傾けたりしないことで、インサート膜上の大腸片片の分布が不均一になるのを防ぎましょう。
8. 2.5x-10x対物レンズの下、位相差光学顕微鏡にプレートを置き、細胞の結合と拡散を監視して合流単分子膜を形成します。
9. 1〜2日後にはほとんどのフラグメントがコラーゲンマトリックスに付着します。培養培地を更新し、Y-27632およびCHIR 99021での処理を中止してください。ミディウムを2〜3日ごとにリフレッシュし続け、合流します。コンフルエンシーは通常7〜10日で到達します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパネジオール	シグマ	T4661	トリス塩基、溶解バッファーの成分
A-83-01	トクリス	2939	ALK4/5/7阻害剤
酢酸、氷河	フィッシャー・サイエンティフィック	A38
高度なDMEM/F12	ライフ・テクノロジーズ	12634-010	成長培地の構成要素
抗生物質/抗菌薬のカクテル	インビボジェン	ANT-PM-2	プリモシン(100倍)
B27、50倍	ライフ・テクノロジーズ	17504-044	成長培地の構成要素
細胞培養挿入	コーニング	3470	トランスウェル、PET膜、0.4 μm孔径、24ウェルプレート
CHIR 99021	トクリス	4423	GSK3β阻害剤
ヒト胎盤由来のコラーゲンIV	シグマ	C5533
カルトレックスオルガノイド収穫溶液	トレヴィゲン	3700-100-01	基底膜マトリックスを脱重合します
エタノール、絶対	ファームコ	111000200
グルタマックス	ライフ・テクノロジーズ	35050-061	L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、200 mM
HEK293T/Noggin-Fc 細胞株	ティットガット肝腸研究所 van den Brink 研究所		ノギン調整培地の製造用
HEK293T/RSPO1-Fc-HA細胞株	トレヴィゲン	3710-001-K	Rspondin-1調制培地の製造
HEPES、1 M	ライフ・テクノロジーズ	15630-080	成長培地の構成要素
ヒト表皮成長因子(EGF)	研究開発システム	236-EG-01M	成長培地の構成要素
逆さ細胞培養光学顕微鏡	オリンポス	CKX51
L-WNT3A細胞株	ATCC	CRL-2647	Wnt3a調整培地の製造用
マトリゲル、成長因子を還元した	コーニング	356231	3D培養用の基底膜マトリックス
ミニセルスクレーパー	ユナイテッド・バイオシステムズ	MCS-200
MUC2抗体、マウスモノクローナル	アブカム	AB11197	免疫染色には1:100、免疫ブロッティングには1:500で使用してください
MUC2 shRNAレンチウイルス粒子	GEダルマコン	RHS4531	GIPZレンチウイルス性shRNA、識別番号:4583
軌道シェーカー	グラント・インストゥルメンツ	PSU-10i
ペニシリン・ストレプトマイシン、100倍	ライフ・テクノロジーズ	15140-122	成長培地の構成要素
マイクロチップ付きプローブソニケーター	ブランソン超音波	450
哺乳類細胞用のプロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ	P8340	溶解バッファーの成分
SB 202190	トクリス	1264	p38 MAPK阻害剤
塩化ナトリウム	シグマ	S3014	溶解バッファーの成分
デキソイコール酸ナトリウム	シグマ	D6750	溶解バッファーの成分
ドデシル硫酸ナトリウム	シグマ	L3771	溶解バッファーの成分
TrypLEエクスプレス、1回	ライフ・テクノロジーズ	12605-010	腸状体や大腸の断片を消化するためのトリプシン
ビンキュリン抗体、ウサギモノクローナル	アブカム	AB129002	免疫ブロッティングのために1:1000で使用してください
水、組織培養グレード、無菌ろ過	コーニング	25-055
Y-27632	トクリス	1254	RhoA/ROCK阻害剤