グラム陰性菌からの球状体生成

要約

出典: フィゲロア, D. ほか 抗菌ペプチドの局在を特徴づけるための細菌スフェロプラストおよびプロトプラストの生成と可視化。 J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオは、桿状グラム陰性菌からスフェロプラストを調製する方法を示しています。細菌は抗生物質の存在下で培養され、細長いフィラメントを形成します。これらは高張溶液で洗浄され、外側細胞壁を除去するために溶解緩衝剤で処理されます。低張性処理はスフェロプラストを形成し、冷えた等張性溶液で安定化し、冷温条件下で保存します。

プロトコル

1. 溶液の調製

注:大 腸菌 (E. coli) 球体体を作るために、ステップ1.1–1.9に記載された溶液を準備してください

1. 10.34 g トリス・HClと4.17 gのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris·OH)を125 mLの蒸留水(dH₂O)に溶かして、pH 7.8のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris-Cl)を125 mLフラスコで調製します。25mmのシリンジフィルターに0.2μmの膜を装着して消毒し、円錐形の管内で室温で保存します。
2. 溶液A(20 mM塩化マグネシウム(MgCl₂)、0.7 Mスクロース、10 mM Tris-Cl、pH 7.8)を25 mLのdH₂Oに溶かして125 mLフラスコに調製します。500 μL 1 M Tris-Cl(pH 7.8)を加え、体積を50 mLに調整します。25mmのシリンジフィルターに0.2μmの膜を装着して消毒し、円錐形の管内で室温で保存します。
3. 溶液B(10 mM MgCl₂、0.8 M ショ糖、10 mM Tris-Cl、pH 7.8)を125 mLフラスコの中で25 mLのdH₂Oに溶かして準備します。500 μL 1 M Tris-Cl(pH 7.8)を加え、体積を50 mLに調整します。25mmのシリンジフィルターに0.2μmの膜を装着して消毒し、円錐形の管内で室温で保存します。
4. ショ糖13.69g(342.3 g/mol)を125 mLフラスコの50 mL dH₂Oに溶かして0.8 Mショ糖を調製します。25mmのシリンジフィルターに0.2μmの膜を装着して消毒し、円錐形の管内で室温で保存します。
5. 50mLフラスコに3 mLのdH₂Oに溶かして、5 mg/mLのデオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)を製製します。25mmのシリンジフィルターに0.2μmの膜を装着して消毒してください。マイクロフュージチューブに溶液を分割し、−20°Cで保存します。
6. 0.125 Mエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA、pH8.0)を125 mLフラスコの中の15 mL dH₂Oに溶かして調製します。25mmのシリンジフィルターに0.2μmの膜を装着して消毒し、円錐形の管内で室温で保存します。
7. 125mLフラスコの中で、セファレキシンハイドレート0.03g(365.404 g/mol)を50 mLのdH₂Oに溶かして600 μg/mLのセファレキシンを調製します。25mmのシリンジフィルターに0.2μmの膜を装着して消毒し、4°Cの円錐形管内に保存します。
8. 50 mLフラスコに3 mLのdH₂Oに溶かして、5 mg/mLのリゾザイムを調製します。25mmのシリンジフィルターに0.2μmの膜を装着して消毒してください。マイクロフュージチューブに溶液を分割し、−20°Cで保存します。
9. 3%のトリプチカーゼ大豆ブロス(TSB)を2リットルのフラスコに溶かして、30gのTSBを1LのdH₂Oに溶かして調製します。溶液を25 mLまたは100 mLのTSBを含むフラスコに分割し、それぞれ大腸菌球体またはB. メガテリウム原生体の調製に使用されます。液体培地を滅菌するためのオートクレーブフラスコ。滅菌TSBは室温または4°Cで保存できます。
10. 溶液C(ショ糖1m、マラ酸塩0.04M、MgCl₂、pH6.5)を250mLフラスコに溶かして、ショ糖34.23g(342.3g/mol)、マレ酸0.46g(116.07g/mol)、0.38g MgCl₂(95.21g/mol)を250mLフラスコに溶かして調製します。pHを6.5に調整してください。25mmのシリンジフィルターに0.2μmの膜を装着して消毒し、円錐形の管内で室温で保存します。

2. オーバーナイト培養の準備

注意:セクション2〜3は適切な無菌技術を用いて実施してください。必要に応じて、細菌株に抗生物質耐性のプラスミドを入れて潜在的な汚染を減らすこともできます。抗生物質耐性のある品種を使用する場合は、必要な抗生物質をステップ2.1および3.1–3.2で追加します。

1. 無菌ピペットの先端で細菌の単一コロニーを選び、2〜3mLの3%およびVT TSBを含む14mLの培養チューブに入れて一晩培養液を準備します。37°Cで16〜21時間振った状態で孵化させます。

3. グラム陰性大腸菌スペロプラストの製製

1. 250 mLフラスコで、25 mLの3% w/v TSBに1:100の一晩培養液を希釈し、37°Cで細菌溶液を培養し、約2.5時間振って溶液が600 nmで0.5〜0.8の光学密度に達するまで加熱します。分光光度計を使って光学密度を測定します。
2. 250 mLフラスコで、この培養物を3% w/v TSBの30 mLに1:10で希釈し、37°Cでインキュベートします。60 μg/mL(347.4 g/mol)の存在下で2.5時間振ると、約50〜150 μmの単細胞フィラメントが得られます。これは光学顕微鏡で1,000倍倍で観察可能です(図1B)。
3. フィラメントは1,500 x g、4°Cの遠心分離で4分間採取します。上清液をデカントして捨て、ペレットを保存します。
4. フィラメントを1mLの0.8Mショ糖を優しく加え、ペレットを乱さないように注意してください。1分間培養し、その後ペレットを乱さずに上澄液を捨てます。
5. 150μLの1 M Tris-Cl(pH 7.8)、120 μL 5 mg/mL リゾザイム、30 μL 5 mg/mL DNase I、120 μL 0.125 M EDTAをそれぞれの順序でペレットに加え、室温で10分間培養します。
6. 1mLの溶液Aを、3.5で準備した溶液に1分かけて、マイクロピペットで手で優しく攪拌しながら加えます。溶液を室温で4分間孵化します。
7. 4°Cの溶液Bを2本の15 mLの円錐形チューブに7 mL入れます。これら2本のチューブそれぞれに3.6で調製した溶液を等量加えます。溶液を1,500 x g、4°Cで4分間遠心分離します。
8. 血清学ピペットを使い、ペレットを乱さずに1〜2mLを除き慎重にすべて除去します。P1000マイクロピペットで優しく上下にピペットを動かしてペレットを再懸垂させます。光学顕微鏡で1,000倍倍の試料を観察し、球状体の形成を目視で確認してください(図1C)。
9. スフェロプラストは-20°Cで最大1週間、または3回の凍結融解サイクルを経るまで保存します。

結果

図1:大腸菌の代表画像。(A)大腸菌、(B)大腸菌ヘビ、(C)大腸菌球体。画像は100倍倍で撮影されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリズマ水素化物(トリスHCl)	シグマ	T3253
トリズマ基地(トリスOH)	シグマ	T1503
塩化マグネシウム	シグマ	M8266
ショ糖	シグマ	S7903
リソザイム	シグマ	L6876
デオキシリボヌクレアーゼI	シグマ	D4527
エチレンジアミネテトラアセティック酸	シグマ	106361	元のプロトコル開発ではSigma 106361を使用しました。106361はED2SSを置き換えて廃止されました
セファレキシンハイドレート	シグマ	C4895
BBLトリプチカーゼ大豆ブロス	フィッシャー・サイエンティフィック	B11768
マレック酸	シグマ	M0375
アクロディスク 25mmシリンジフィルター(0.2 μm HT タフリン膜付き)	パル・コーポレーション	4192