膣群 B連鎖球菌 感染のマウスモデルの確立

要約

出典: パトラス、K. A.、ドラン、K. S.グループ B連鎖球菌 膣定着のマウスモデル。 J. Vis. Exp. (2016年)

この動画は、グループB 連鎖球菌 のホルモン治療メスマウスの調合と膣内接種の方法を示し、感染モデルとして示しています。細菌の培養と調製方法、膣腔への接種方法、そして感染の成功を確実にする方法を説明しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. グループB連鎖球菌(GBS)による膣内接種

1. 接種の前日に、関心のあるGBS株(例えばA909(血清型Ia)を、トッド・ヒューイットブロス(THB)で37°Cで5mlの一晩液体培養します。
2. GBSを1:10の体積で一晩培養し、新鮮THBに含めて37°Cで培養します。細菌を中期ログフェーズ(OD₆₀₀ = 0.4-0.5)まで培養します。

注: GBSの株によっては、通常2〜3時間かかります。

3. サブカルチャーを無菌の15ml円錐形チューブに移し、細菌を3,000×gで5分間ペレットします。上清液を吸引してください。細菌ペレットを200μlの滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)に再懸浮させます。
4. 再懸濁ペレットを使い、新しい5ml培養チューブで3〜5mlのPBS(10マウスあたり1ml)を正確にOD₆₀₀ = 0.4まで取り込みます。濃度は1 ×^{10 8} コロニー形成単位(CFU)/mlとなります。新しい15mlの円錐形チューブに移し、3,000×gで5分間再びペレットで細菌を注入します。上清液を吸引してください。
5. ペレットをPBSで元の1/10の音量で再懸浮させます。例えば、OD₆₀₀ = 0.4を3 mlペレット化した場合、それを300 μlのPBSで再懸濁します。

注: これは動物接種に使われる最後の細菌懸濁液(~ 1 ×^{10 9} CFU/ml)です。

6. この懸濁液を50μl保存し、THB寒天で希釈およびプレートを施し、正確な接種量を決定します。
7. 最終細菌懸濁液を10μlずつ各マウスに接種し、1×10^{7 CFU} を投与します。
   1. 接種するには、ハンドラーの親指と人差し指の間に首の首根付近のたるんだ皮膚を固定し、尾を動かさずに手動で拘束します。
   2. GBSを10μl、200μlのゲルローディングピペットチップに抽出します。先端を膣内腔に5〜10mm挿入し、10μlの接種液を投与します。
      注: 特に若年または小型マウスにおいて、臓器外傷や損傷のリスクを最小限に抑えるため、標準的な200μlチップよりもジェルローディングチップが好まれます。
   3. 接種直後、首の後ろ根を解放し、後ろの先端を持ち上げ、尾を持ち上げて硬い表面を前足で~1分間歩かせます。
   4. 膣の開口部を目視で点検し、接種の逆流がないか確認してください。逆流が観察された場合は、新しいピペットの先端を使って膣の開口部を操作または拡大し、逆流が内腔内に取り込まれやすくなります。さらに、逆流はピペットで吸引し再接種することもあります。
      注: 局所薬剤、プロバイオティクス、または関心のあるタンパク質を投与する場合は、膣内に最大20μlの生理的緩衝液を投与することがあります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
200μlゲルローディングピペットチップ	USAサイエンティフィック	1252-0610
トッド・ヒューイット・ブロス	ハーディ・ダイアグノスティクス	7161C
ダルベッコのリン酸塩緩衝塩溶液 1回	コーニング	21-031-CV