病原性細菌における酵素誘発バイオフィルム抑制の定量化

要約

出典:Tay, S. B.ら。工学的クォーラムクエンチングラクトナーゼを用いた病原性バイオフィルムの抗病原性破壊。 J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオは、病原性細菌のバイオフィルムバイオマスを定量化する方法を示しており、未処理の対照群とクォーラムクエンチング酵素で処理されたサンプルを比較しています。この酵素は初期培養中に細菌のシグナル伝達を妨害し、細胞の付着を減少させます。洗浄とさらなる培養後、制御井戸は密度の高いバイオフィルムを形成し、処理井戸では形成が減少します。バイオフィルムを染色するために陽イオン性染料を使用し、吸収率を測定してバイオマスを評価します。

プロトコル

1. A. baumannii S1におけるバイオフィルム形成の結晶紫定量

1. ア シネトバクター・バウマンニーS1 (A. baumannii)を溶生ブロス(LB)(トリプトン10 g/L、酵母抽出物 5 g/L)で、30°Cの振動インキュベーター(220 rpm)で16時間培養します。
2. A . baumannii S1の培養を、600 nm(OD₆₀₀)で望ましい光学密度0.8に調整します。96ウェルプレートを用いて、細菌培養(希釈1:100)を新鮮なLBに接種し、精製GKL酵素10μl(40 mg/ml)を含む。新しい培養物の最終容量は100μLです。
3. コントロール培養も準備してください。この中には酵素は含まれません。同様の条件を繰り返して、望む複製数を得ます。
4. プレートに蓋をして、密閉された10リットルのプラスチック容器に入れます。培地を30°Cで3時間孵化した後、優しく培地を取り出します。
5. さらに100μlの新鮮LB培地をウェルに加え、プレートを30°Cで21時間培養します。
6. 2回目の培養期間終了後、すべての培地を優しく取り除きます。プランクトニック菌の細胞を200μlの滅菌水で洗浄します。洗浄時の細胞への影響を最小限に抑えてください。
7. 各ウェルに1%クリスタルバイオレット溶液100μlを加え、室温で15分間培養します。200μlの滅菌水で井戸を洗浄して結晶バイオレット溶液を除去します。洗濯をさらに2回繰り返します。
8. 各ウェルに33%酢酸を100μl加え、15分間優しく振って培養します。これで染料が溶けます。
9. 600nmで結晶バイオレットの吸光度を測定して生成されるバイオフィルムの量を定量化します。結晶バイオレットの量は、生成されるバイオフィルムの量に比例します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリプトン	BD	211705
酵母エキス	BD	212750
96ウェルプレート	共演者	3596
クリスタル・バイオレット	シグマ・オルドリッチ	C6158
酢酸	ラボスキャン	PLA00654X	注意:可燃性
Synergy HTマイクロプレートリーダー	バイオテック