酵素媒介によるバイオフィルム形成阻害の顕微鏡的評価

要約

出典: テイ、S. B. et.al。 工学的クォーラムクエンチングラクトナーゼを用いた病原性バイオフィルムの抗病原性破壊。 J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、細菌の細胞シグナル伝達を妨害する酵素を導入することでバイオフィルム形成を阻害する過程を実演しています。この酵素は細菌が細胞外高分子物質を生成するのを防ぎ、ガラス底のマイクロディッシュ上でバイオフィルムの発生を抑制します。最後に、蛍光レクチンと共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてバイオフィルム構造を可視化します。

プロトコル

1. A. baumannii S1バイオフィルムの共焦点レーザー走査顕微鏡

1. 5mlの A. baumannii S1をLBで30°Cの振動インキュベーター(220rpm)で16時間培養します。

2. A. baumannii S1の培養を目標のOD₆₀₀ 0.8に調整する。35mmのガラス底のμ皿を用いて、細菌培養(1:100希釈)を30μlの精製GKL酵素(40 mg/ml)を含む新鮮なLBに接種します。『ザ・ニュー・カルチャー』の最終巻は1 MLです。

3. μ皿に蓋をして密封された10リットルのプラスチック容器に入れます。μ皿を30°Cで3時間孵育した後、培地を優しく取り除きます。精製されたGKL酵素30μlと新鮮培地を加え、合計体積を1mlにします。さらに30°Cで21時間培養します。

4. ステップ1.3を繰り返し、μ皿をさらに24時間30°Cで孵化します。その後、培地を優しく取り除きます。

5. 500μlの5μg/mlアレックス・フルオ488共役小麦胚球凝集素(WGA)をハンクのバランス塩溶液(HBSS)に溶けてμDishに加え、37°Cで30分間培養します。これにより形成されたバイオフィルムが染みます。染色液を取り除き、μ皿を2mlのHBSSで洗います。もう一度洗う工程を繰り返します。

6. HBSSに溶けた3.7%ホルムアルデヒド500μlを加え、37°Cで30分間培養する。これでバイオフィルムがμ皿に固定されます。μDishを2mlのHBSSで一度洗い、その後溶液を完全に除去します。バイオフィルムで固定されたμ皿は、CLSMイメージング前に4°Cの暗闇で保存できます。

7. CLSMのイメージングおよび解析において、63倍倍の倍率を用いて、1枚の画像につき0.21μmの間隔で97スタックを生成します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリプトン	BD	211705
酵母エキス	BD	212750
96ウェルプレート	共演者	3596
酢酸	ラボスキャン	PLA00654X	注意:可燃性
μ皿	イビディ	80136
アレックス・フルオ488活用型WGA	インビトロジェン	W11261
ハンクのバランス塩溶液	インビトロジェン	141475095
ホルムアルデヒド	シグマ・オルドリッチ	F8775	注意:腐食性
Synergy HTマイクロプレートリーダー	バイオテック
1X-81 逆形蛍光顕微鏡	オリンポス