ポリメラーゼ連鎖反応を用いた二元培養における糖類細菌の検出

要約

出典: Collins, A. J. ら、 口腔内共生糖菌の安定二元培養の確立。 J. Vis. Exp. (2021年)

この動画では、 アクチノマイセス を用いた二元培養において、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて糖類細菌を検出する方法を示しています。プロトコルは、安定した宿主-寄生虫相互作用を確認するためにDNA増幅とゲル電気泳動を概説しています。

プロトコル

1. PCRによる糖類菌感染の確認
   1. 5回の通過後に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で感染を確認します。5回の通路により、25サイクルのPCRで非増殖の糖類細菌細胞が検出限界を超えて枯渇していることが保証されます。
   2. PCRマスターミックスを準備してください。推奨されるレシピは以下の通りです:必要な各チューブに対して、12.5 μL 2x PCRバッファー、0.75 μL 10 μM フォワードプライマー(580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C)、0.75 μL 10 μM リバースプライマー(1177R¹³- GAC CTG ACA TCC CCT CCT TCC)、1 ΜL 25 MM MgCl_{2 を準備します。そして} 9μLの水。渦巻きで混ぜます。
   3. マスターミックス24μLを0.2 mLのPCRチューブにアリコートします。PCR反応に1μLの糖菌感染培養液を追加します。チューブをサーモサイクラーに入れ、次の手順を実行します:95°Cで5分間の初期変性、95°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで30秒、最終伸長を72°Cで2分間、最後に4°Cで保持します。
   4. PCR産物を1%アガロースゲルでロードして走査します。約600塩基の帯は糖類細菌の存在を示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	フィッシャー・サイエンティフィック	BP160-100
ブレインハートインフュージョンブロス(脱水粉末)	ベクトン・ディキンソン	211059	または標的生物に適した他の成長培地
電気泳動電源	バイオ・ラッド	1645052
電気泳動リグ	バイオ・ラッド	1704467
ゴタック・グリーン・マスターミックス	プロメガ	M7122
マスターサイクラー プロ サーモサイクラー	エッペンドルフ	950040025	またはPCR用の同等のサーモサイクラーを使うこともできます
MgCl₂溶液25mM	プロメガ	A3513
分子生物学グレードの水	フィッシャー・サイエンティフィック	BP2819100
P-1000マイクロピペット	ギルソン	F123601G
PCRチューブ 0.2 mL	フィッシャー・サイエンティフィック	14-230-205
ピペットチップ - 1000 μL	フィッシャー・サイエンティフィック	02-717-166
SYBR Safe DNA ジェル染色	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	S33102
トリプティック大豆ブロス(脱水粉末)	ベクトン・ディキンソン	211825	または標的生物に適した他の成長培地