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注:実験全体を通じて、マクロファージ細胞は37°Cで5%CO2 の強制空気インキュベーターで培養され、実験操作のためのみインキュベーターから取り出されます。操作はクラスIIの生物学的安全性キャビネット内で行われます。 リステリア・モノサイトゲネス 菌の扱いは、生物学的安全レベル2の規制に従って行われます。
1. 細胞調製と細菌感染(1日目と2日目)
- 1日目
- 種子2.0 x 10個の7 個骨髄由来マクロファージ細胞(BMDM)を145mmディッシュに、30mlのBMDM + ペン溶連菌培地で使用(表2)。分析対象の細菌株ごとに3枚のプレートをシードします。5%CO2 の強制空気インキュベーターで37°Cで一晩培養します。
- 野生型(WT) L. monocytogenes 株10403Sを、10mlの脳心臓注入(BHI)培地で、標準インキュベーターで30°Cで一晩培養を開始します。振動せずに斜めに培養チューブを配置します。
注:これらの成長条件は鞭毛遺伝子の発現を上方調節し、効率的な感染を促進します。
- 2日目
- 37°Cで、前温めたBMDM培地(ペン溶連菌抗生物質なし)(表2)とリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を37°Cで使用。
- 抗生物質を除去するために、マクロファージ単分子層を25mlの予備温めたPBSで2回洗浄します。新鮮なBMDM培地30mlを加えます。
- 1.5mlの細菌培養液をPBSで洗浄し、細菌を14,000 x g>で遠心分離して1分間洗浄し、上清液を捨て、ピペットで1.5mlのPBSに優しく再懸濁させます。これを2回繰り返します。
- 各マクロファージプレートに、野生型 L. monocytogenesの洗浄した一晩培養液0.5mlを感染させます。複数のプレートを使う場合は、それぞれ15分間隔で感染させてください。この期間により、感染終了時に各プレートを個別に採取することが可能になります。
注:感染の多重性(MOI)は、感染用細菌培養液をBHI寒天プレート上で連続希釈してプレートし、37°Cで24時間培養後にコロニー形成単位(CFU)を数えることで測定されます。0.5mlのWT L. monocytogenes 株10403Sを使用すると、MOIは~100(マクロファージ細胞あたり100細菌CFU)となります。細胞内増殖に欠陥のある細菌変異体を解析する際には、より高いMOIを考慮する必要があります。 - 37°Cで0.5時間の培養後、感染細胞をPBSで2回洗浄して未付着細菌を除去し、30mlの予温済みBMDM培地を加えます。付着した細菌は次の0.5時間で内部化します。
- 感染後1時間後にゲンタミシン30μl(最終濃度50μg/mlに1:1,000)を加えて細胞外細菌を殺します。
- フィルター装置は、真空出口ポート付きの液体フラスコにフィルターヘッドを取り付けて組み立てます。次にフィルターヘッドに0.45μmのフィルターを置き、その後シリンダーのじょうごを置き、金属製のクランプで各部品を固定します。氷のように冷たいRNaseフリーの水を用意してください。
- 感染後6時間後、感染細胞から以下のように細菌を採取します。皿ごとに個別に処理してください。
注:通常、 L. monocytogenes はマクロファージ細胞の感染6時間の間に1-ログの増殖を完了します。長期の培養は細菌の過剰増殖やマクロファージの細胞死を引き起こす可能性があり、短い培養期間は細菌負荷が大幅に減少する可能性があります。感染部位のMOIや感染時期は最適な条件に調整できます。- 感染した細胞をPBSで一度洗浄してください。溶除マクロファージ細胞に氷のように冷たいRNaseフリー水20mlを加えます。細胞スクレーパーを使って、素早く慎重にプレートから細胞をこそげ落とします。
- 溶解した細胞を50mlの円錐形チューブに集めます。30秒間渦巻き。遠心分離機で800 x gで4°Cで3分間加熱します。
- 真空システムを使って上清液をフィルター装置に通します。ピンセットを使ってフィルターを巻き、素早く15mlの円錐形チューブに移します。フィルター付きのチューブを液体窒素でスナップフリーズします。
- 1.2.7で説明されている通り、次の試料用の新しいフィルターでろ過装置を組み立てます。
- 冷凍フィルターは翌日-80°Cで保存してください。あるいは、直接核酸抽出に進む方法もあります。
表1:DNase反応プロトコル。
| RNA | 最大2μg(最大体積44μl) |
| 10倍のDNaseバッファ | 5μl |
| RNaseフリーの水 | 総体積50μlまで完全 |
| DNAse | 1μl(1単位) |
表2:培地とバッファーのレシピ。
| 1. 500mlのBMDM+Pen-Strep培地(フィルター滅菌済み): | |
| ダルベッコ改良型イーグル・ミディアム(DMEM) | 235ml |
| 胎児用牛血清(FBS)(54°Cで30分不活化) | 100ml |
| マクロファージコロニー刺激因子、すなわちM-CSF(L-929調整培地) | 150ml |
| グルタミン | 5mlです |
| ピルビン酸ナトリウム | 5mlです |
| β-メルカプトエタノール | 0.5ml |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 5mlです |
| 合計 | 500ml |
| 2. 500 ml BMDM(フィルター滅菌): | |
| DMEM | 235ml |
| FBS(54°Cで30分後に非稼働) | 100ml |
| M-CSF(L-929調和培地) | 150ml |
| グルタミン | 5mlです |
| ピルビン酸ナトリウム | 5mlです |
| β-メルカプトエタノール | 0.5ml |
| 合計 | 500ml |
| 3. AEバッファ | |
| 酢酸ナトリウム(NaOAc)pH 5.2 | 50 mM |
| エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA) | 10 mM |
| RNaseフリーの水 | |
| 4. フェノール-クロロホルム-IAA | |
| フェノール | 25ml |
| クロロホルム | 24ml |
| イソアミルアルコール | 1ml |
| 5. クロロホルム-IAA | |
| クロロホルム | 24ml |
| イソアミルアルコール | 1ml |