感染マウスマクロファージから採取した リステリア・モノサイトゲネス からのRNA抽出

要約

出典:シガル、N.ら。マクロファージ細胞内の細胞内培養リステリア・モノサイトゲネスからのRNA精製。J. Vis. Exp.(2016年)

この動画は、感染マウスのマクロファージから単離された リステリア・モノサイトゲネス からのRNA抽出を示しています。プロトコルはRNAを保存し、フェノール・クロロホルムと加熱による細胞を溶解し、遠心分離によってRNAを分離します。塩とエタノール、そしてコールドインキュベーションの組み合わせはRNA沈殿を促進します。その結果生まれたRNAは宿主誘導遺伝子発現を捉え、細菌の病原性と適応戦略を明らかにします。

プロトコル

1. 核酸抽出

注: フェノールとクロロホルム溶液を用いて、すべての操作はフームフード内で行ってください。

1. 各サンプルごとに400μlの酸性化フェノールとクロロホルムを1:1の混合液で準備します。別々のチューブを混ぜてから、抽出した水層を吸引で抽出します。10%のSDSを40μl加えます。
2. フィルター入りのチューブは氷の上で解凍して冷やしておく。各フィルター入りチューブに650μlの酢酸EDTA(AE)バッファー(50 mM NaOAc pH 5.2、10 mM EDTA、RNaseフリー水)を加えます。
3. 以下の手順をできるだけ早く実行してください。
   1. フィルターを収めたチューブを激しく旋回させ、フィルターがチューブの周辺に向かい、バッファーがフィルターを完全に洗浄します。チューブは必ず氷に戻して冷たい状態に保ちましょう。
      注: フィルターから細菌を完全に洗い流すために、逆さまの状態でチューブをさらにボルテックスで洗い流す必要があるかもしれません。
   2. 全てのチューブで同じことを繰り返します。プロセスの最後にサスペンションを短時間(120 x gで1分間)スピンダウンさせるのが有用かもしれません。
4. 細菌を含むバッファーをSDSとフェノール/クロロホルム混合液を含む1.5mlのマイクロ遠心分離機チューブに移します。全てのチューブで同じことを繰り返します。フィルター内のチューブを120 x gで1分間回して、フィルターから残留バッファーを得る必要がある場合があります。
5. 1.5mlのチューブをすべてマルチチューブのボルテックス装置に入れ、10分間全速力でボルテックスを続けます。
6. チューブを65°Cのヒートブロックで10分間孵化させます。最大速度(> 14,000 x g)で5分間遠心分離機を操作します。
7. 各チューブから水溶液(約400μl)を、3M酢酸ナトリウム40μl(pH5.2)と1.0mlの100%エタノールを含む新しい1.5mlチューブに移します。各チューブを徹底的にボルテックスしてください。
   注: この段階でグリコーゲンを加えることで、沈殿ペレットの可視化が改善されます。
8. サンプルは-80°Cで1時間キュベートします。または、サンプルを-20°Cで一晩培養する方法もあります。その後、4°Cで最大速度(>14,000×g)で20分間遠心分離します。
9. 各チューブからエタノール(上層)を慎重に吸引してください。各サンプルに500μlの冷たい70%エタノールを加え、十分にボルテックスします。遠心分離機は4°Cで最大速度(> 1 4,000 x g)で20分間使用します。
10. 各チューブからエタノールを慎重に吸引してください。真空蒸発器で加熱なしで約2分間乾燥させます。サンプルを過度に乾燥させないでください。
11. 各サンプルに25μlのRNaseフリー水を加えます。室温で20分間培養します。慎重にボルテックスとスピンダウンを。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リステリア・モノサイトゲネス 10403S
H2O、RNAse フリー	サーモ・サイエンティフィック	10977-015	DEPC処理水も使用可能です
フェノール飽和pH 4.3	フィッシャー	BP1751I-400
クロロホルム	フィッシャー	BP1145-1
イソアミルアルコール	シグマ・オルドリッチ	W205702
酢酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	W302406
EDTA	シグマ・オルドリッチ	EDS
SDS 10%	シグマ・オルドリッチ	L4522
エタノール絶対	メルク・ミリポール	1070174000
MF-ミリポアフィルター 45 mm、0.45 μm	メルク・ミリポール	HAWP04700
ボルテックス・ジーニー2	科学産業	モデルG560E
65°C ヒートブロック	サーモ・サイエンティフィック
4°C テーブル遠心分離機	エッペンドルフ	5417R
滅菌ピペット、25ml	グライナー
ファルコンチューブ、50ml	グライナー
1.7mlチューブ、RNaseフリー	アクシゲン	MCT-175-C
SpeedVacシステム	サーモ・サイエンティフィック	SPD131DDA