感染マウス膀胱内の細胞内細菌群集の可視化

要約

出典: Conover, M. S. 他著、 『マウスモデルにおけるUTIおよびCAUTIの確立と特徴付け』。 J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオは、βガラクトシダーゼ発現性 大腸菌に感染したマウス膀胱組織における細胞内細菌群集(IBCs)の検出を示しています。組織固定、透過化、X-gal染色の後、IBCは解剖顕微鏡下で青い点として現れ、尿路感染症における細菌侵入を確認します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 尿路病原性大腸菌(UPEC)細菌接種製剤

1. 尿路感染症(UTI89)接種を準備してください(接種日の72時間前から開始)
   1. 冷凍ストックからLB(ルリア・ベルターニ)寒天プレートにUTI89をストリークしました。37°Cで一晩培養します。コロニーを選び、125mlのフラスコに10mlのLBに接種します。37°Cで24時間静的に培養します。
   2. 新しい125mlフラスコに10mlのLBに10μlの培養液を10ml、37°Cで静静的に24時間接種します。
   3. 菌株や接種量によって異なる3mlを無菌1.5mlチューブに移し、7,000 x gで3分間遠心分離機でペレットを1xリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)に再懸浮させ、遠心分離機で2回目にします。細菌ペレットを1mL、1xPBSに再懸濁させます。
2. 細菌の光学密度を測定し、接種量を希望の接種密度に調整します。使用される接種物の標準濃度は107菌種です。ただし、これは研究の設計によって異なる場合があります。

2. 細菌接種

1. 作業台を70%エタノールで清掃し、吸収性の紙で覆うか(または滅菌フローフードを使用)してください。
2. 準備した細菌接種剤を最大0.9mlを1mlのツベルクリン(TB)シリンジに抽出します(気泡を除去)。10(PE10)チューブサイズの準備済み滅菌接種針を注射器に取り付け、その後ポリエチレンチューブを滅菌トリミングします。
   注: 膀胱を刺さないように、針の先端の上に1mmのチューブを残してください。
3. 1インチ四方のパラフィルムを切り取り、その上に約10セント硬貨ほどの外科用潤滑剤を少し塗ります。
4. メスのC3H/HeNマウスは、製造元のプロトコルに従い蒸気化チャンバーに入れて、意識を失うが正常に呼吸できるまで麻酔します(1秒1回)。
   注意: イソフルランは吸入麻酔薬です。換気の良い場所で使用し、吸入を最小限に抑えましょう。
5. ネズミをベイパライザーから取り出し、ペーパータオルの上に仰向けに置き、脚を広げます。
6. ネズミの鼻を鼻に鼻をコーティングし、麻酔を維持するために蒸気器に接続された管(一部の蒸気器に付属している制御されたイソフルランの投与量を提供するチューブ)を装着します。
7. 膀胱を優しく触診して排尿を促し、膀胱が空くようにしてください。尿道周辺を100%エタノールワイプで拭き取ってください。接種針/注射器を先に外科用潤滑剤に軽く当てます。
8. 接種針を尿道内(約12mm)に挿入し、注射器プランジャーを優しく押し込んで膀胱内に接種液を10μl/秒で注入し、各マウスに50μlの細菌溶液を接種します。接種針をマウスから外してください。
   注: 接種開始時に尿道口で接種が即座に戻るのは、針の挿入が不適切または不完全であることを示します。
9. ネズミを鼻のコーンから外し、ケージに戻します。各マウスごとにステップ2.3から2.8を繰り返します。接種条件や品種を切り替える際は、注射器と接種針を認可されたシャープス容器に保管し、ステップ2.2から再開してください。
   注: 尿路病原性微生物の接種は、一般的に激しい痛みの症状を引き起こしません。しかし、稀に大量の病原体投与が発熱、食事や水分摂取の減少、異常行動を引き起こすことがあります。実験期間中、動物の健康状態は監視されるべきです。明らかな痛みの症状が見られる場合は、ブプレノルフィン(0.05−0.1 mg/kg)などの鎮痛剤を皮下投与することができます。

3. 細胞内細菌群集(IBC)の列挙

1. 無菌的に膀胱を取り出し、シリコン底の6ウェルプレートに1xのPBSを入れます。プレートはシリコーンエラストマーキットを用いて準備でき、各ウェルに約1cmのシリコーンを注ぎます。ハサミで膀胱を半分に切ります。
2. 小さな金属ピンを使って、膀胱を優しく広げて膀胱のルーメンが上向きになるようにします。ピンは膀胱の最も外側の端に設置し、尿路上皮を最大限に露出させるようにしてください。
3. 広げた後は、PBS1回で膀胱を優しく洗います。ピペットで1xのPBSを除去します。膀胱を直すには、広がった膀胱全体を覆うために3%のパラボルマルデヒドを十分に加えます。
   注意: パラホルムアルデヒドは発がん性があります。手袋を含む適切な防護具を常に着用してください。処分は施設のガイドラインに従うべきです。
4. 室温で1時間培養します。パラホルムアルデヒド溶液を除去してください。PBSを1回洗ってください。
5. LacZウォッシュ液(2 mM MgCl₂、0.01%デオキシコレートナトリウム、0.02% ノンイデット-p40、1x PBSで)を3回、1回の洗濯で5分間洗います。
6. 洗浄液を除去し、膀胱を覆うのに十分なLacZ染色(9.5mlのLacZ洗浄液、0.4mlの25 mg/ml Xガロン、100 mM K-フェロシアン化物/K-フェリシアン化物0.1ml)を加えます。30°Cで一晩、光を遮って孵化させます。
7. インキュベーターから広げた膀胱を取り出し、解剖用スコープで40〜60倍の拡大で青い点として見えるIBCを観察します。
   注: 時には、尿道下にチューブを挿入する前にマウスが排尿することもあります。この場合、再び尿を採取しようとする前に15〜20分待ってください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
感染のための物質:
イソフロッラン – アイソテージア	バトラー・シャイン	29405	250ml
透明ガラスの直線型ジャー	キンブル・チェイス	5413289V 21
ステンレス製のティーインフューザー	シェフス・アマゾン		Schefs製プレミアムリーフティーインフューザー - ステンレススチール製 - 大容量 -
非滅菌コットンボール	フィッシャーブランド	22-456-880
50mlファルコンチューブ	VWR	89039-660
Isotec 3 - ヴェポライザー	オーメダ	1224478
耳パンチ	フィッシャー・サイエンティフィック	13-812-201	(必要に応じて)
ベタジン溶液	ベタジン溶液		10%ポビディヨウ素外用溶液
綿棒	フィッシャー・サイエンティフィック	22-037-924	6インチ
ベンチ用おむつ	フィッシャーブランド	14206 63	吸収性アンダーパッド(20インチ×36インチマット)
外科用潤滑剤	サーギルブ	0281-0205-36
解剖はさみ	ファインサイエンスツールズ、INC	14084-08
マイクロアドソン鉗子	ファインサイエンスツールズ、INC	11018-12
1mlシリンジ	BD	309659	ツベルキュリンスリップチップ
パラフィルム	ベミス	PM996	4インチ×125フィート
エッペンドルフラック	フィッシャーブランド	05-541-1
エッペンドルフ管	中科学	AVX-T-17-C
IBC教材:
6ウェル組織培養テストプレート	テクノ・プラスチック・プロダクツ	92006
ピン	ファインサイエンスツール	26002-20
シルガルド 184	ダウ・コーニング	3097358-1004	シリコーンエラストマーキット
X-ガル(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-D-ガラクトシド)	インビトロジェン	15520-034	超純粋
N、N-ジメチルホルムアミド	シグマ・オルドリッチ	D4551
塩化マグネシウム	シグマ・オルドリッチ	M8266
デオキシコール酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	D6750
ノニデ-P40	ロッシュ	11754599001	オクチルフェノールポリ(エチレングリコレテル)n
六サシアノフェレートカリウム(II)三水和物(K-フェロシアン化物)	シグマ・オルドリッチ	P3289
六サシアノフェレートカリウム(III)(K-フェリシアン化)	シグマ・オルドリッチ	60299