アグロバクテリウム媒介による組換えウイルスクローンをトウモロコシの苗木への遺伝子沈黙投与

要約

出典: Beernink, B. M. ほか トウモロコシ苗の直接グロノコシ接種(リコンビナント・フォックステールモザイクウイルスおよびサトウキビモザイクウイルス感染クローンによる注射)。 J. Vis. Exp. (2021年)

この動画は、 アグロバクテリウム媒介による組換えウイルスクローンをトウモロコシの苗に送達し遺伝子サイレンシングを行う様子を示しています。この研究は、 アグロバクテリウム 感染、全身ウイルスの拡散、RNA干渉による表現型変化の過程を概説しています。

プロトコル

1. 注入
注: 4〜7日齢のトウモロコシの苗は注射に使用できます。苗の成長速度は、成長条件、光合成活性放射線(PAR)(すなわち温室内のPARが成長室より高い)、遺伝子型など、温室環境で制御が難しい要因に大きく影響されます。植物は葉が伸びていない高さ2〜3cmの若虫から4日、最も下の丸い先端の葉が膨らんでいる7日目から注入可能です。この接種法の成功率は、播種後7日を超えると急速に低下します。苗の年齢に関係なく、注入部位は同じです。

1. 安全ゴーグルを着用し、細菌の懸浮液を1mLの使い捨て注射器につなぐ25G x 5/8インチの針で、1 mLの使い捨て注射器につなげて、コレオプティラ節の2〜3 mm上に苗に注入します。
   注: 冠根が最終的に形成されるのは、冠状節です。ここは植物の最も低い節です。通常、ノードの下部で緑から白に色が変わります。注射部位は分組組織のすぐ上にあります。この段階で数株の苗を解剖することで、分子組織の位置を把握し、適切な注入部位を把握するのに役立ちます。
2. 植物の成長段階に応じて、懸流液が鞘を満たすか輪の中で見えるまで、注射器に優しく圧力をかけます。これは約100〜200μLの懸濁量に相当します。
   注: 懸濁液を苗に注入するのが難しい場合は、注入部位が低すぎる場合があります。サスペンションを注入するには中程度の圧力で十分です。
3. すべての苗を注入し、各構造物ごとに注射器や針を交換します。

2. 植物の継続的な管理

1. 注入した苗は、生後7〜8日のときに13×13×15cm以上の鉢に移植します。
2. 成長条件(16時間の光周期と週1回の施肥)を維持してください。

3. 感染の確認(表現型的)

1. 植物の表現型は接種後14〜21日(DPI)の間に評価されます。対照遺伝子の 病変模倣22 や フィトエン脱サチュラーゼ による病変は葉に容易に見られ、FoMVの症状とは区別されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1mLシリンジ	フィッシャー・サイエンティフィック	14955450	あるいは、BD 309659
アグロバクテリウム・トゥメファシエンス株 GV3101			ラボ在庫からVirプラスミドをコードするT-DNA転送機構RifR、GmRを搭載しています
肥料			ピーターズ肥料 15-15-15 濃縮
大きな壺	コルドロック	SQL0550	5x5x4インチ以上。苗の移植用です。
トウモロコシゴールデンバンタムスイートコーンシード	アメリカンメドウズ、西海岸種子
土壌基質	サングロ園芸	SS#1-F1P	サンシャインミックス#1/ファファード-1P、トウモロコシがよく育つ土壌ミックスなら何でも十分です