出典: Schlafer, S, および Frost Kristensen, M. 共焦点顕微鏡を用いたクロスキングダムバイオフィルムの細胞外pHモニタリング。 J. Vis. Exp. (2020年)
このビデオは、口頭条件下で Streptococcus mutans と Candida albicans のクロスキングダムバイオフィルムを培養し、細菌と真菌の相互作用をモデル化し、口腔病原における微生物の相乗効果、グルカン媒介の付着、酸原性病原性の研究を可能にします。
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方法論記事
口腔病因研究のための細菌–真菌クロスキングダムバイオフィルムの確立
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2026年2月26日
この記事について
要約
プロトコル
サンプル採取に関わるすべての手続きは、研究所のIRBガイドラインに従って実施されています。
1. 王国横断バイオフィルムの培養
- 好気条件下で37°Cの血液寒天プレート上で、 Streptococcus mutans(S. mutans DSM 20523)および Candida albicans (C. albicans) NCPF 3179を培養します。
- 各微生物の単一コロニーを5mLの脳心臓注入(BHI)を詰めた試験管に移します。好気条件で37°Cで18時間育てます。
- 培養液を1,200 x gで5分間遠心分離します。上清液を廃棄し、生理食塩水に細胞を再懸濁させ、C. albicans(約107 cells/mL)およびS. mutans(~108 cells/mL)に対してOD550 nmを0.5に調整します。S. mutansの懸液を無菌生理食塩水(~107 cells/mL)で1:10希釈します。
- 無菌唾液50μLを光学式底面96ウェルプレートのウェルにピペットで注ぎ、顕微鏡観察を行います。37°Cで30分間培養します。ウェルを100μLの無菌生理用塩水で3回洗います。井戸を空にしろ。
- 各井戸に100μLの C. albicans 懸濁液を加えます。37°Cで90分間孵化します。無菌生理食塩水で3回洗い。
注: 洗浄中に井戸を完全に空にしないでください。過剰なせん断力を避けるために20μLのリザーバーを残してください。 - 各ウェルに100μLの熱不活化胎児牛血清(56°Cで30分間不活化)を加えます。37°Cで2時間培養します。無菌生理食塩水で3回洗い。井戸を空にし、20μLの貯留層を残します。
- 各ウェルに100μLの S. mutans 懸濁液(ステップ1.3で準備)を加えます。5%のショ糖を含むBHIを150μL加えます。37°Cで24時間以上培養します。古いバイオフィルムを培養する際は、毎日培地を新鮮なBHIに切り替えてください。クロスキングダムのバイオフィルム成長期の終わりに、無菌生理食塩水で5回洗浄します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 血液寒天プレート | ステイテンス血清研究所 | 677 | |
| 脳心注入 | オキソイド | CM1135 | |
| 脳心臓輸注+5%ショ糖 | BDH実験用品 | 10274 | |
| カンジダ・アルビカン | 病原菌類国立コレクション | NCPF 3179 | |
| 胎児用牛血清 | Gibco Lifeテクノロジーズ | 10270 | |
| GS-6R冷蔵遠心分離機 | ベックマン | 該当なし | |
| μプレート96 ウェルブラック | イビディ | 89626 | |
| 無菌生理食塩水 | VWR | 6404 | |
| ストレプトコッカス・ミュータン | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| 可視分光光度計 V-3000PC | VWR | 該当なし |
