バイオフィルム形成中のリアルタイムイメージングおよび圧力追跡のためのマイクロ流体装置

要約

出典: Kurz, D. L., 他 多孔質培地におけるバイオクロッキングを研究するためのマイクロ流体プラットフォーム。 J. Vis. Exp. (2022年)

このビデオでは、バイオフィルム形成を研究するためにマイクロ流体装置を用いる方法を実演しています。マイクロチャネルに細菌懸濁液を導入し、その後培養してバイオフィルムの形成を可能にします。その後、流れを再開し、圧力モニタリングと画像画像を用いてバイオフィルムの形成や孔の詰まりを時間経過で検出します。

プロトコル

1. シリコンウェハーの準備

1. コンピュータ支援設計(CAD; 材料表参照)ソフトウェアでマイクロ流体チャネルの形状を設計し、それを透明フィルムに印刷してフォトマスクを作成します(図1A)。
2. 以下の手順に従い、クリーンルーム条件下でソフトリソグラフィでマスターモールドを製作します。
   1. シリコンウェハーを200°Cで2時間焼きます。
   2. ウェハーをスピンコーターの中央に置き、SU8 3050フォトレジスト( 材料表参照)をウェハーに注ぎます。スピンコートは1,700rpmで40秒、10秒/100rpmのランプ時間で使用します。
      注: スピンコーティングパラメータはSU8 3050の目標厚さ100μmを得るために設定されました。
   3. スピンコーティング工程の後、シリコンウェハーを65°Cで600秒、95°Cで2,700秒間ソフトベイクします。ウェハースを室温で一晩冷やします。
      注: 一晩の冷却により、SU8のウェハへの接着力が強化されます。
   4. フォトマスク(ステップ1.1)をウェハーに置き、250 mJ/cm²の露光エネルギーで350 nmの波長でUV光を照射します。
   5. 露出後、露出した基材を65°Cで60秒、95°Cで300秒焼きます。
   6. マスターモールドを得るために、mrDev600現像液を充填したビーカーに浸してシリコンウェハーを現像します( 材料表参照)。ビーカーを1,800秒ほど優しく振って、未重合レジストを洗い流します。その後、シリコンウェハーにイソプロパノールをスプレーしてスプラッシュウォッシュし、自然乾燥させます。
   7. シリコンウェハーを200°Cで1,800秒ハードベイクします。
3. マスターモールドをシラン化し、20μLのトリクロロ(1H、1H、2H-パーフルオオクチル)シラン(材料 表参照)を型の隣のガラススライドに40分間置き、真空乾燥器で40分間処理し、計圧100 mbarを作り出します。

2. マイクロ流体装置の製造

注: ここで説明する製造手順は、1つのマイクロ流体チャネルを持つマイクロ流体デバイスです。しかし、同じ方法で複数のマイクロ流体チャネルを並列に持つマイクロ流体デバイスの製造にも応用できます。

1. エラストマーと架橋剤を10:1の比率で混ぜ( 材料表参照)、ポリジメチルシロキサン(PDMS)混合物を準備します。混合物を均一に混ぜ、閉じた空気の泡で不透明になるまでかき混ぜます。
2. 混合気を真空乾燥器で脱ガスし、閉じ込められた気泡が取り除かれ透明になるまで100mbarの計圧力を作り出します。脱ガスにかかる時間は通常30分です。
3. マスター型(ステップ1)を細胞培養皿に置きます( 材料表参照)。マスターモールドに20gのPDMS混合液を注ぎ、最終厚さ5mmのチャネルを作ります。
4. マスター型を70°Cで2時間焼きます。
5. 硬化したPDMSを約3mmの距離でブレードで切り出し、マスターモールドからPDMSのマイクロフルイディックチャネルを剥がします。
6. マイクロ流体チャネルの入口と出口を作るために、その末端(三角形の上部、 図1A参照)に直径1.5mmの生検パンチで穴を開けます。後で圧力センサーを取り付けるために、入口の三角形の中央にもう1つ穴を開けてください。
7. ガラススライドとマイクロ流体チャネルを市販の1%洗剤溶液( 材料表参照)で5分間洗浄し、その後脱イオン水で洗い流します。その後、PDMSのマイクロ流体チャネルとガラススライドをイソプロパノールで洗浄します。その後、脱イオン水で再度洗い流します。PDMSのマイクロ流体チャネルとガラススライドを1バールの圧縮空気で1分間乾燥させます。
   注: 結合が効果的であるためには、PDMSの多孔質構造が完全に乾燥していなければなりません。
8. ガラススライドとマイクロ流体チャネルをプラズマクリーナーに入れ( 材料表参照)、接着する面が上を向いていることを確認してください。プラズマクリーナーを起動し、マイクロ流体チャネルとガラススライドを空気プラズマで1分間、1SL/h(標準リットル毎時間)のエアフローで処理します。クリーナーから取り出したらすぐに、マイクロ流体チャネルをガラススライドに接触させて接着してください。
   注: 処理された表面には触れないように注意してください。接着に影響を及ぼす可能性があります。複数のマイクロフルイドチャネルを持つマイクロ流体デバイスを作る際は、マイクロフルイドチャネルを同時に露出させ、一段階で結合します。
9. 結合されたマイクロフルイディックデバイスを80°Cのホットプレートに少なくとも15分間置きます。
10. マイクロ流体装置は実験開始まで清潔な細胞培養皿に保管してください。

3. 細菌懸濁液の準備

1. 実験開始前に、凍結グリセロールストックから栄養ブロスNo.3培養培地3mL(材料表参照)を15mL培養チューブで直接接種し、20時間間バチルス・サブティリスNCIB 3610の個体群を培養します。30°C、200rpmのシェイキングインキュベーターで一晩(16時間)孵卵します。
2. 実験開始4時間前に、15mLの培養管に3μLの新鮮培地(希釈1:1,000)を加え、一晩培養からサブカルチャーを作成します。サブカルチャーをシェイキングインキュベーターで30°C、200rpmで3.5〜4時間培養し、600nm(OD₆₀₀)での光学密度0.1を得る。

4. バイオフィルム成長実験

1. 実験の3時間前に顕微鏡の箱型インキュベーターを起動し、25°Cの安定した温度を確保します。シリンジポンプと圧力センサーを取り付けます( 材料表参照)。
2. 入口と出口のチューブをマイクロ流体装置に接続します。チューブと注射器の接続を固定するために、外径0.6mmの針を直接入口チューブに挿入します。
3. マイクロ流体装置、30 mLの脱イオン水、30 mLの培養培地を真空乾燥器に入れ、少なくとも1時間ほど脱ガスします。次に、培養培地と脱イオン水をゆっくりと2本の30mLシリンジに分けます。
   注: この工程は培養培地で洗浄する際にチャネル内での気泡形成を防ぐために非常に重要です。
4. マイクロフルイディック装置を顕微鏡に取り付け、出口チューブを廃棄物容器に入れます。
   1. 脱イオン水で満たされた注射器をマイクロフルイドチャネルに接続し、圧力センサーの出口から水を排出するまでゆっくりと注入します。圧力センサーに水を入れ、マイクロフルイドチャネルと圧力センサーをつなぐチューブの泡をすべて洗い流してください。圧力センサー専用のネジで圧力センサーの出口を閉じてください。
      注: 記載された充填手順により、マイクロ流体チャネルの入口での圧力変化が正確に記録されます。複数のマイクロ流体チャネルで実験を行う際は、各チャネルを別々の注射器に接続し、すべてのチャネルで均等な流量条件を確保します。
5. 残りのマイクロ流体チャネルを脱イオン水で満たします。
6. 培養媒体注射器に1.2μmのフィルター( 材料表参照)を置きます。その後、水注射器を取り外し、培養培地注射器を入口のマイクロ流体チューブに慎重に接続します。注射器をシリンジポンプに取り付け、チャネルを培養培地で2 mL/hの流量で1時間洗浄します。
   注: フィルターは、注入時に細菌細胞が注射器に入るのを防ぎます。マイクロ流体チャネルを培養培地で洗浄することで、多孔質構造内の残存する気泡を除去できます。
7. 実験中にシリンジポンプを所望の流量(ここでは1 mL/h)に設定し、圧力センサーの圧力読み取り値をゼロに設定します。
   注: 初期圧力測定値をゼロに設定することで、実験中にバイオフィルムの発生によって生じる圧力差のみが測定されます。
8. 細菌培養液を1mL、OD₆₀₀ 0.1で1.5mL遠心分離バイアルにピペットします。出口チューブを遠心分離バイアルに入れてマイクロ流体チャネルに細菌培養液を充填します。チューブの出口から潜在的な気泡を除去するために5分間待機した後、マイクロ流体チャネルに細菌培養液が満たされるまで、150μLの細菌溶液を1 mL/hの流量で抽出します。
9. 培養用メディア用シリンジフィルターを慎重に取り外し、出口を廃棄物容器に入れます。細菌細胞はマイクロ流体チャネル内でゼロフロー状態に3時間放置し、多孔質培地内で表面付着を促します。
   注: 細菌細胞をゼロフロー条件で3時間放置することで、細菌株の付着に最適化され、十分な酸素化された細菌培養が確保されました。他の細菌株は時間がかかる場合もあれば短くもあればします。
10. 実験を開始するには、シリンジポンプを希望の流量(ここでは1 mL/h)に設定し、圧力読み取りを1 Hzから始めます。
11. 成長中のバイオフィルムを、所定の時間間隔、光学配置、拡大率で画像取得します。​
    注: 本研究では、明視野モードで4倍倍率の画像を、多孔質媒質の全領域にまたがる18位置で6分ごとに取得し、24時間にわたり取得しました。

結果

図1:マイクロ流体チャネルの設計および実験装置。 (A) 異なる孔径(75μm、150μm、300μm)を持つマイクロ流体チャネルのフォトマスクを多孔質メディアのアナログとして使用し、柱の配置をズームインして表示します(下段)。円は柱(不透水障害物)の位置を示し、多孔質の固体相を表しています。(B) 実験装置の回路図で、注射器、圧力センサー、マイクロ流体装置(単一のマイクロ流体チャネル)、および対物レンズ(...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アクロディスク 25 mm シリンジフィルター、1.2 μm ヴェルサパー膜	パル・コーポレーション	PN4190	1.2μmフィルター
BD 10 mL シリンジ(ルーアロック)	BD	300912	チャネルを脱イオン水で満たすために使われました
ボックスインキュベーター	ライフイメージングサービス		バイオフィルム成長実験中に温度が安定していた
セル密度計 CO8000	WPAバイオウェーブ		ODメーター
遠心分離バイアル	エッペンドルフ	30120086	1.5 mL
セトニ・ベース120	セトニ有限会社		シリンジポンプ
CorelCAD	コレルドロー		マイクロ流体チャネルの形状設計に使用されたソフトウェア
培養チューブ(14mL、滅菌)	グライナー・バイオ・ワン		培養チューブ
乾燥オーブン、VENTI-Line	VWR		PDMS硬化のためのオーブン
便利だ	ミグロス		洗剤溶液
温度制御付きのホットプレート	VRW		プラズマ処理後のPDMSとガラス結合の硬化
イノバ42インクシェイカー(ニューブランズウィック州)	エッペンドルフ		インキュベーター
イソプロパノール(> 99.8%)	シグマ・オルドリッチ	67-63-0
マスターフレックストランスファーチューブ	マスターフレックス	HV-06419-05	内径0.020インチ、外径0.06インチ
マイクロスライド、プレーン、75 x 60 mm	コーニング	2947-75X50	ガラススライド
マイクロ流体圧力センサー(1バール)	エルブフロー		圧力センサー
ミルテックス生検パンチャー、直径1.5mm	インテグラ		マイクロ流体チャネルの入口と出口の穴を開けるためのパンチング
mrDev600 開発者	マイクロレジスト
ニコン エクリプス Ti2	ニコン・インストゥルメンツ		顕微鏡
栄養スープ第3号	シグマ・オルドリッチ
ルアーロック付きオムニフィックス・シリンジ	B.ブラウン		異なる容量の注射器
プラズマチャンバー ゼプト	ダイナー・エレクトロニック	ゼプト-1	PDMSとガラススライドのプラズマ結合に使用されます
精密ワイプ(Kimtech Science)	キンバリー・クラーク	KCP-7552	ガラススライドを乾かすために
スケール	VWR-CH	611-2605	エラストマーと架橋剤の比率を計量するために使用されます
シリコンウェハ(10cm)	シリコン・マテリアルズ社		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
スピンコーター、スピンモジュール SM150	サワテック
SU8 3050フォトレジスト	カヤクアム
Süss MA6マスクアライナー	SUSSマイクロテックグループ		クロームガラスマスクの整列に使用されます
シルガルド 184	ダウ・コーニング		シリコーンエラストマーキット;硬化剤
テクニ・エッチ CR01	テクニック		テクニック
組織培養皿150	TPP	93150
トリクロロ(1H、1H、2H、2H パーフルオロオクチル)シラン	シグマ・オルドリッチ	シグマ・オルドリッチ	シリケートウェハーのシラン化に使用されます
Veeco Dektak 6 M	ヴィーコ		プロフィロメーター