植物根表面への細菌の付着の顕微鏡による評価

要約

出典: Matthysse, A. G. 実験室で測定された植物表面への細菌の付着。 J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオでは、位相差顕微鏡を用いて細菌が植物根に付着する様子を実演しています。まず細菌と培養した苗木の根サンプルを採取し、遊離細菌の有無を確認します。その後、サンプルは洗浄して緩く付着した細菌を取り除き、損傷を防ぐために適切なカバースリップで再装着します。最後に、根毛に付着した細菌の数を顕微鏡で数えます。

プロトコル

1. 細菌の接種

1. 細菌の接着性や潜伏期間を測定する測定基準に基づき、接種すべき細菌の数を決定します。
2. 1日未満の培養期間を含む顕微鏡研究では、比較的多数の細菌に接種します。培養液を加えて、最終的な細菌濃度が10⁶ mLを超える状態にします。より長い潜伏期間の場合は、細菌接種量を減らしましょう。
3. 細菌の接着を生存細胞数で測定する研究では、培養量を加えて最終的な細菌濃度を10³ 〜10⁶ mLにします。
4. 細菌をあまりにも多く入れすぎて、その代謝によって培養培地内のpHや酸素濃度が変わるのは避けましょう。pHは紙や電極を使って測定してください。酸素電極を使って酸素濃度を測定します。
5. 砂で育てられた植物については、3つの方法で接種します。
   1. 植える前に、種を1mLあたり約10〜⁶ 個の水に浸して1分間浸して、種に細菌を接種してください。
   2. 根にアクセニックの苗を発芽させて接種します。苗の根が約1cmの長さになったら、10〜⁶ 菌/mLの懸液に浸すか、苗全体を1分間水に浸します。
   3. 植え付け前に砂と細菌を混ぜて、最終濃度は約^10.3菌/mLにするか、植え付け後に10.6菌/mLの懸濁液で苗に水やりをします。

2. 細菌と植物材料の培養

1. 液体培地での培養には、細菌と植物材料を無菌水、ショ糖および鉱物塩、または植物組織培養培地(例:村重とスクーグの基礎塩混合物を1:10希釈したものやMS塩)で培養します。
   1. 細菌が付着しない容器を使いましょう。植物の表面は、浸かすか優しくかき混ぜて常に覆い続けるようにしてください。激しい攪拌は付着を妨げたり、植物表面から細菌を除去したりすることもあります。
   2. 植物の材料を光学顕微鏡で観察し、培養を停止し測定を行うタイミングを判断します。接着の時間経過はしばしば価値があり、相互作用の速度に応じて1〜4時間ごと、または1日ごとに採取されます。
2. 砂で培養する場合は、ステップ2.1で液体培地での培養に説明したのと同じ注意点を適用してください。

3. 顕微鏡を用いた接着の測定

1. 表面の細菌を簡単に観察できるように、ノマルスキーや位相差光学で顕微鏡測定を行いましょう。しかし、倍率20倍以上の明視野顕微鏡ならいずれでも使用できます。
   1. 顕微鏡観察を用いて、細菌がランダムに分布しているのか特定の場所にいるのかを判断してください。また、単独で結合されているのかクラスターで結合しているのかも確認してください。癒着後に細菌の増殖や閉じ込めを示唆するマイクロコロニーの存在を探してください。細菌が表面にバイオフィルムを形成しているかどうかも確認してください。
      注:バイオフィルムとは、多数の細菌が表面に結合し、細胞外マトリックスに囲まれたものです。構造は滑らかで均一なものから、より複雑な構造を持つこともあります。
   2. 蛍光マーカーでタグ付けされた細菌を使いましょう。他にも細菌が存在し、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タグで対象細菌が特定された場合、蛍光顕微鏡を用いてタグ付けされた細菌が他の細菌のクラスターに存在しているかどうかを判断します。GFPの場合は、励起490 nm、発光520 nmのフィルターを使います。
      1. 蛍光タグが細菌に悪影響を与えていないか、ノマルスキー光学と蛍光光学の両方を用いて野生型細菌とタグ付け細菌の等量混合を観察して細菌に悪影響を与えていないか確認します。蛍光菌と暗色菌がランダムに混ざり合い、同じ数で存在する場合、タグはアッセイに干渉しませんでした。
2. 付着した細菌の数を決定します。
   注:顕微鏡で付着した細菌の数を特定するのは非常に困難です。結合が不規則な植物表面の場合、定量的な測定は一般的に不可能です。走査型電子顕微鏡(本記事では触れていません)は、このような測定を行うために使用できます。
   1. 細菌が根毛のような滑らかな表面に結合した場合、根毛の長さ1mmあたりに結びついている細菌の数を数えます。測定時は、ほぼ同じ大きさと形の根毛を使い、測定を比較するように注意してください。
   2. 顕微鏡で物体のサイズを測定するには、測定された刻印が施された市販スライドを使用します。このスライドを実験材料と同じ設定で観察・撮影し、得られた画像を使って顕微鏡写真の物体のサイズを測定します。
3. 顕微鏡検査のためにサンプルを準備しろ。
   1. サンプルを洗いましょう。サンプルを水滴または培養液の一滴に移し、顕微鏡スライドで直接観察します。
      注:この方法の利点は、細菌の増殖や実際の細菌死がなければ、遊離細菌があまり存在しない可能性が高いという点です。遊離細菌が存在しないことは、培養容器に細菌が死んだり結合したりした可能性がある警告サインとみなしてください。試料を洗浄する効果は 図1に示されています。
   2. サンプルを液体の入ったバイアルに入れて優しく逆さまに洗い流し、水または培養培地で優しく洗い流します。次に、サンプルを新鮮な液体に浸したものの顕微鏡スライドに置いて観察します。
   3. 通常のカバースリップと顕微鏡スライドを使って試料を液体に取り付けます。
      1. サンプルが厚くてカバースリップの下に膨らみができる場合は、プレスアパルカバースリップを使いましょう。カバースリップの縁にはゴムやプラスチックのリングが付いています。液体とサンプルをカバースリップのウェルに入れ、スライドをその上に置いて優しく押してカバースリップをスライドに密着させます。ひっくり返して調べてください。
      2. あるいは、藻類カウントスライドとカバースリップを同様の方法で使用することもできます。この深さのスライドは、一般的に20倍以上の対物レンズで鑑賞することはできません。

結果

図1:結合細菌の数を決定するための試料準備の手順。 アグロバクテリウム・トゥメファシエン スはトマトの根毛(A、B、C)およびナイロン糸(D、E、F)に結合します。洗浄せずに水中に埋め込んだサンプルでは、結合した細菌(黒い矢印)と遊離細菌(白い矢印)の両方(AおよびD)が確認できます。洗浄後、結合した細菌は残りますが、遊離細菌は存在しません(BおよびE)。超音波処理後、結合した細菌(CおよびF)は試料表面から除去されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
光顕微鏡	どんなものでも	該当なし	位相コントラストやノマルスキー光学が役立ちますが、蛍光マーカーを用いた研究には蛍光顕微鏡が必要です。
種子	どんなものでも	該当なし	種子ロット番号と品種をメモしてください
ブリーチ	どんなものでも	該当なし
バスソニケーター	どの科学用品会社でも	該当なし
トライトン X-100	シグマ・オルドリッチ	T9284
栄養寒天	ディフコ	2001-01-08
ソイトーン	ディフコ	24360
砂	海砂 フィッシャー・サイエンティフィック	S25
砂	シグマ・オルドリッチ	S9887
コンテナ	スチューウェ&サンズ社	レイ・リーチ・コーン・テイナー	育てたい植物の種類に合わせて、さまざまなサイズのものが用意されています
パラフィルム	どの科学用品会社でも	該当なし
MS塩	シグマ・オルドリッチ	M5524
セジウィック・ラフター計数セル	ハウザー・サイエンティフィック	HS3800
プローブクリッププレスシールインキュバチンチャンバー	シグマ・オルドリッチ	Z359483
リファンピシン	シグマ・オルドリッチ	R3501