がん性上皮細胞の シゲラ 感染による応力顆粒の形成

要約

出典: Vonaesch, P. ら、 哺乳類細胞の細菌挑戦後のストレス顆粒形成の免疫蛍光解析。 J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオは、病原性細菌シ ゲラ・フレクスネリ による上皮細胞の感染と、それに伴う宿主細胞の応答を示しています。細菌のエフェクタータンパク質は宿主の翻訳を妨げ、膜のない小器官であるストレス顆粒の形成を引き起こします。これは細胞の感染に対する適応的応答を反映しています。

プロトコル

1. 細菌および宿主細胞の調製

1. 12mmまたは14mmのガラスカバースリップを、それぞれ24ウェルまたは12ウェルプレートに無菌ピンセットで転送し、実験条件ごとに1つのウェル数をカウントします。これらは組織培養フードで紫外線(UV)処理で15分間滅菌します。
   注: 細菌チャレンジおよび外因性ストレスによる応力顆粒(SG)誘導のための対照井戸を含める。
2. 24ウェルプレートに12 mmのカバースリップがある場合は、カバースリップに1×10⁵ 個の哺乳類細胞(例: HeLa細胞)をシードします。カバースリップを滅菌ピペットの先端で押し下げます。細胞は37°Cで、各細胞タイプに適した培地で5%_CO2 組織培養インキュベーターで一晩接着します。
   注: 翌日に細胞の合流率が40〜60%になるようにプレートを塗ります。
   1. HeLa細胞の場合は、非必須アミノ酸(NEAA)および10%脱補質胎児乳牛血清(FCS)を含んだDulbeccoの修飾Eagle培地(DMEM)でインキュベートします。FCSを脱補相化するために、56°Cの水浴で30分間加熱し、15分後に1回巻きます。
3. 細菌をストライク状に取り除きたい場合は、滅菌ピペットの先端を使って、-80°Cの冷凍庫に保存された細菌グリセロールストック(20%グリセロール)から少量を除去し、ラベル付きのプレートに置きます。滅菌ループを使って、細菌をプレートの約10%に広げます。新しい滅菌ループを使い、塗布に通して3本の平行線(半皿分)を作ります。これらの線を通って、プレートの残りを覆うように。37°CでO/Nプレートを培養します。
   1. 新たにストリークしたプレートから単一の細菌コロニー(例:シゲラ・フレクスネリ)を選びます。1週間以上の細菌群落は避けてください。
   2. S. flexneri株M90Tでは、新たにストリークしたトリプティック大豆寒天-0.1%コンゴ赤寒天プレートから赤いコロニーを15mLチューブ内の8mLのトリプティック大豆ブロスに接種します。蓋をしっかり閉め、222rpmのO/N、30°Cで振動させて培養します。注意:大きな白色コロニーは病原性プラスミドを失い、感染性がないため使用しないでください。

2. 宿主細胞の細菌的挑戦

1. 感染の可能性を最大化するために細菌を準備しましょう。
   1. S. flexneriの場合、8mLのトリプティック大豆寒天に150μLのO/N培養を加え、222rpm、37°Cで振動させて後期指数関数的段階(~2時間)まで培養し、病原性遺伝子発現を誘導し感染を促進します。
      1. 培養液の光学密度が0.6から0.9(600 nmで測定)になった場合、1 mLの培養液を1.5 mLのチューブに移します。ペレット菌を8,000 x gで2分間、感染培地(DMEMとNEAAでFCSなし)に再懸浮させ、OD₆₀₀ = 1で投与します。したがって、OD₆₀₀ が0.85であれば、850μLで再懸濁します。
         注: S. flexneriの場合、OD₆₀₀ = 1の場合、8 mL培地で培養すると1 mLあたり8 x 10⁸菌が存在します。感染の多重率(MOI)は20が適切です。他の病原体については、OD₆₀₀における1mLあたりの細菌数と適切なMOIを経験的に決定する必要があります。
   2. 細菌と宿主の相互作用を促進するために、ポリL-リジン(PLL)で細菌をコーティングします。
      注: S. flexneriのPLL治療はSG動態に影響を与えませんでした。他の病原体については、PLL治療への適応度を評価する必要があります。
      1. PLLで細菌をコーティングするには、1 mLの細菌培養液を8,000 x gで2分間遠心分離し、その後、ペレットをリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)で10 μg/mL PLLで外径₆₀₀ =1で再懸濁します。
      2. 細菌溶液を12ウェルプレート内のウェルなどの小さな皿に加え、RT(~20°C)で10分間、皿シェーカーで優しく攪拌しながら培養します。
      3. 8,000 x gで2分間ペレット菌を投与し、余分なPLLを取り除きます。ペレットを1 mL PBSに再懸浮させ、この洗浄工程を2回繰り返します。最終洗浄後、OD₆₀₀ = 1で感染培地に再懸濁します。
         注: ここで、 S. flexneri の感染培地は、FCSなしの20 mM N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES)を用いた宿主細胞培地です。
2. 細胞を細菌の挑戦に備えましょう。
   1. 哺乳類のHeLa細胞から培地を吸引ポンプで除去します。500μLのRT HeLa細胞培地を加えて細胞を洗浄し、攪拌し、吸引ポンプで培地を除去し、500μLの室温(RT)に適した感染培地(例:FCSなしの20 mM HEPESを含む宿主細胞培地)に置き換えます。
   2. 注: すべての洗浄工程では、素早く作業し、一度に最大4枚のカバースリップまで処理して、細胞の乾燥を防ぎましょう。
3. チャレンジは、HeLa細胞に細菌を用いて細胞の20〜50%に感染させました。
   注: 各細菌種ごとに適切な時期とMOIを決定する必要があります。一般的に、37°Cで30分、MOIは10です。
   1. S. flexneriの場合は、2つの方法のいずれか(ステップ2.3.1.1または2.3.1.2)でHeLa細胞に挑戦してください。
      1. 非PLL処理細菌(20μLの_OD600 =1/ウェル、500μL培地)を細胞に13000×gで10分間スピンします。
      2. PLLコーティングされた細菌(OD₆₀₀ 15μL=24ウェルプレート1/ウェル、500μL培地)をRTで15分間追加し、細菌が細胞に定着できるようにします。
   2. 定着した細菌がいる細胞を37°Cの組織培養インキュベーターに30分間置き、感染を待つ。
      注: 短時間の場合は、組織培養インキュベーターではなく37°Cの水浴にプレートを置き、15分間S . flexneri 感染を同期させます。
4. 細胞を洗浄して感染を止めましょう。
   1. 細胞を洗浄し余分な細菌を除去するには、吸引ポンプで培地を取り出し、新鮮に予温された37°CのHeLa培養培地(DMEM、10% FCS、NEAA)を1mL追加します。ミディウムをくるくると回し、取り除いて新しいメディウムに替えます。これを2回繰り返し、細胞に新しい培地を残します。
      1. S. flexneriや他の細胞内細菌の場合、HeLa細胞と洗浄液の感染後、培地を50 μg/mLのゲンタマイシンを含む標準的な組織培養培地に置き換え、細胞外細菌を殺菌し、さらなる細胞侵入を防ぎます。
         注: 細胞外細菌のために培地に抗生物質を加えないでください。
5. 細菌と細胞を組織培養インキュベーターで望む時間だけ培養します。
   注:S. flexneriの場合、感染は細胞の種類によって最大6時間かかることがあります。HeLa細胞の場合、感染を1.5〜2時間進めてから外因性ストレスを加えてSG形成を誘導します。カコ2感染の場合、シゲラが細胞間に広がる場合は、30分から6時間感染した後、外因性ストレスを加えます。この時点で細胞は外因性ストレスを加えずに固定され、細菌感染によるSG形成を評価することができます。

3. 応力顆粒形成の固定および免疫蛍光解析

注: 制御と実験カバースリップを同時に処理し、染色の違いが後の画像解析に影響を与えることを防ぎます。対照サンプルには、SG誘導治療の有無感染およびなしの感染サンプルと、SG誘導治療の有無にかかわらず感染したサンプルが含まれています。

1. 吸着ポンプで培地を完全に除去し、PBS中に0.5mLのRT 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加えてサンプルを固定します。RTで30分間孵化します。
   注意: PFAはハンドラーや環境に有害です。ハンドラーを適切に保護し、化学廃棄物を処分しましょう。
   注: あるいは、15分間固定した後、-20°Cの予冷メタノールに10分間置き換えて、SGマーカーの細胞質局在を保持する方法もあります。
2. PFAをピペットで除去し、適切な廃棄容器に処分してください。カバースリップは1 mLのトリスバッファー生理食塩水(TBS:25 mM Tris、pH 7.3;15 mM 塩化ナトリウム、NaCl)で洗浄します。洗う際に皿のシェイカーで優しく振ってカバースリップを2分間孵化させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シゲラ・フレクスネリ			要望に応じて各研究所から入手可能
トリプトンカゼイン大豆(TCS)ブロス	BDバイオサイエンス	211825	シゲラの標準培養培地、応用 - 細菌増殖
TCS寒天	BDバイオサイエンス	236950	シゲラの標準成長寒天、応用 - 細菌増殖
コンゴレッド	SERVA電気泳動株式会社	27215.01	病原性プラスミドを失った シゲラ の識別ツール、応用 - 細菌増殖
ポリLリジン(PLL)	シグマ・オルドリッチ	P1274	細菌をコーティングして感染を増加させるのに有用で、適用・感染
ゲンタミシン	シグマ・オルドリッチ	G1397	細胞外細菌の選択的殺菌(細胞質細菌は殺さない)、応用 - 感染
ヘペス	ライフ・テクノロジーズ	15630-056	pHバッファーはRTで細胞をインキュベーションする際に有用であり、応用 - 細胞培養
ダルベッコ改良イーグル中型(DMEM)	ライフ・テクノロジーズ	31885	HeLa細胞の標準培養培地、応用 - 細胞培養
胎児の子牛血清(FCS)	バイオウエスト	S1810-100	HeLa細胞培養培地に使用される5%の補給、応用 - 細胞培養
非必須アミノ酸(NEAA)	ライフ・テクノロジーズ	11140	HeLa細胞培養培地に使用される1:100希釈、適用 - 細胞培養
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・オルドリッチ	D2650	試薬希釈剤、応用 - 細胞培養
パラホルムアルデヒド(PFA)	電子顕微鏡のスシーン	15714	4%のPFAは細胞の標準的な固定に使用され、適用・固定
24ウェル細胞培養プレート	シグマ・オルドリッチ	CLS3527	標準的な組織培養プレート、適用 - 細胞培養
12mmガラスカバースリップ	NeuVitro	1001/12	免疫蛍光応用のための細胞培養サポート、応用 - 細胞サポート
鉗子	シグマ・オルドリッチ	81381	ほとんどの蛍光色素に適している安価で頑丈な装着媒体、応用 - 取り付け