マウス腎組織における細菌定着の蛍光イメージング

要約

出典: ベヘラ、R. K.、 他 感染組織における細菌の遺伝子調節を研究するための蛍光ベースの手法。 J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、感染マウスの腎臓組織を二重蛍光リポーターを用いて、DNA染色、細菌遺伝子発現を検出する方法を実演しています。赤はすべての細菌を示し、緑は感染反応性細胞を示します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手続きは、適切な動物倫理審査委員会によって審査・承認されています。

1. 臓器の採取と組織処理
   1. 二次的な方法で_CO2 吸入と子宮頸部脱臼による安楽死を行い、解剖を行います。
   2. 腎臓(右)および心臓、肝臓、肺、脾臓などの重要臓器を採取し、10%[v/v]バッファーホルマリンを含む15 mLのポリプロピレンチューブに移します。
   3. 臓器は暗闇の中、室温で優しく揺らすか回転させて少なくとも24時間、最大48時間はかけて固定してください。
   4. 臓器を透明な組織凍結培地に埋め込み、組織を-80°Cで保存します。
   5. クライオスタットを使い、組織を厚さ10μmのスライスに分割します。
   6. 事前に洗浄済みのチャージガラススライドで暗闇で20分間乾燥させます。4フィート6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)染色とカバースリップを使ったハードマウンティングメディウムを塗布します。硬化スライドを室温で一晩放置し、長期保存のために4°Cに移します。
2. レーザー走査共焦点顕微鏡および画像処理
   1. 使用している蛍光リポーターに適したレーザーを使って病変を特定するためにマウントスライドを検査します。この場合、緑色(GFPまたは緑色蛍光タンパク質)、赤色(tdTomato)、青色(DAPI)蛍光信号が使用されます。
   2. 個々の細胞を可視化する適切な対物鏡(例:通常20倍または40倍の対物レンズが使用)で画像を取得します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57Bl/6マウス	チャールズ川	NA
共焦点レーザー走査顕微鏡	ツァイス	NA
クライオスタットマイクロトーム	サーモ・サイエンティフィック	NA
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	セルグロウ	46-013-CM
Precellys 24ホモジナイザー	バータン研究所	NA
サブXero透明組織凍結培地	メルセデス・メディカル	MER5000
スーパーフロストプラス顕微鏡スライド	フィッシャー・サイエンティフィック	12-550-15
Vectashield アンチフェードマウントメディウム(DAPI搭載)	ベクター研究所	H-1500