生細胞蛍光顕微鏡を用いた細菌の形態変化のイメージング

要約

出典: Brzozowski, R. S. ほか 細菌の細胞内タンパク質局在および細胞形態変化を調査するための生細胞蛍光顕微鏡法。 J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、細菌の形態変化をリアルタイムで可視化するためのライブセル蛍光顕微鏡法を実演しています。リアルタイムで高解像度画像を得るためのイメージング、タイムラプス取得、デコンボリューションの手順を概説しています。

プロトコル

1. イメージング

1. 実験当日、顕微鏡システムを起動しろ。デスクトップの該当アイコンをクリックして画像ソフトウェア(材料 表参照)を起動してください。ソフトウェアの起動ダイアログボックスにある「 顕微鏡の初期化 」オプション(顕微鏡が表示されたボタン)をクリックして顕微鏡を初期化します。初期化前に顕微鏡の粗調整で対物レンズを完全に下げることを確実にしてください。
   注: 初期化後、スタートメニューに加えて、resolve3D、データ収集、フィルターモニターの3つのダイアログボックスが表示されます。
2. 製造元が提供した100倍オイル浸漬物レンズ(数値絞り=1.4、作業距離=0.12mm; 材料表参照)に1.517(屈折率)のオイルを滴します。
   注: 画像検査を行う温度に適した浸漬油を選ぶことが重要です。
3. サンプルを入れたガラスの底皿を金属製のハウジング(棺)に入れ、優しくステージクランプに滑り込ませます。
4. 粗い調整ノブを使って対物鏡を持ち上げ、オイルが皿のガラス底に触れるまで調整します。接眼レンズと微調整ノブを使ってサンプルをピントに合わせます。セルがピントが合ったら、顕微鏡本体前面にあるセレクタースイッチを左に動かして、接眼レンズからカメラモードにノブを回します。
5. 画像診断ソフトウェアを使って実験を開始します。 resolve3D ウィンドウで、フラスコで示された「 設計/実験実行 」アイコンを選択します。「 設計/実験実行」という新しいダイアログボックスが現れるべきです。
   1. 設計図でZスタック数と試料厚さを設定し、設計/実験実行ダイアログボックスのセクションタブを操作します。
      注: 代表的な結果セクションの実験では、静止画像用に200 nm間隔の17個のZスタック、タイムラプス顕微鏡用に200 nm間隔の4つのZスタックが使用されました。
   2. サンプル内のセルの厚さを測定するには、 resolve3D ダイアログボックスの上下矢印を使ってZ面を段階的に手動で調整します。画像取得の上限と下限として、セルがピントが合わない場所をマークしてください。実験を実行する前にこの情報をインポートしてください。
   3. タイムラプスイメージング中の光毒性や光漂白を最小限に抑えるために、Zスタックの数を減らし、画像取得のためにセルの中間面を選びます。
6. 設計図から実験に適したフィルターセットを選択し、その後設計/実行実験ダイアログボックス(TRITC: EX 542/27)のチャンネルタブを選びます。EM 597/45;FITC/GFP:EX 475/28;EM 525/48;mCherry:EX 575/25;EM 632/60;Cy5:EX 632/22;EM 676/34)。
   1. また、POL/DIC情報の収集には参考文献を選択してください。画像処理前に選択した各チャンネルの透過率(光強度)と露光時間は、 resolve3D ダイアログボックスの適切なオプションを選択して調整できます。
      注: 実験対象外の視野角でこれらの設定をテストし、選択したパラメータが弱い信号を見逃したり過飽和したりせずに意味のある蛍光データを得られるかどうかを判断します。そしてこれらのパラメータを実験セットアップにインポートします。
7. resolve3Dダイアログボックスのポイントリストボタンを選択してポイントリストを開きます。新しいダイアログボックス「ポイントリスト」が現れるはずです。顕微鏡のステージコントロールを使って適切な視野角を見つけ、ポイントリストダイアログボックスでマークポイントオプションを選択して、実験で使用する複数の視野をマークします。
   注: 顕微鏡がポイントリストの一点に再焦点を合わせるたびに、置換点を選択する必要があります。これは、顕微鏡をリスト内の適切なポイントに合わせ、置 換ポイント ボタンを選択することで行えます。リフォーカス時にアナログの粗・微調整ノブに触れないことが重要です。フォーカス調整はソフトウェアだけで調整してください。
8. まず設計を選択し、その後設計/実験実行ダイアログボックスで タイムラプス タブを選択してタイムラプスのパラメータを設定します。タイムラプスのチェックボックスを選択してください。タイムラプス画像や総時間という形で適切なタイムラプスパラメータを入力します。
9. ポイントリストからイメージするポイントを設定するには、まず 設計 を選択し、その後デザイン/実験実行ダイアログボックスの ポイント タブを選びます。訪問ポイントリストオプションを選択し、完全なシーケンスの場合はカンマまたはハイフンで区切ったテキストボックスに画像化するポイントを入力します。
10. 実験を始める前に、デザイン/実行ダイアログボックスの 実行 タブを使ってファイル名やファイル位置を編集してください。ファイル位置は 設定 ボタンを選択し、データフォルダを選択し、適切なフォルダを選択するか新しいフォルダを作成することで変更できます。ファイル名の変更は、画像ファイル名のテキストボックスに新しいファイル名を入力して変更できます。
11. 実験開始ダイアログボックスの再生ボタンを選択して実験を開始します。
    注: タイムラプスでは、実験中ずっとDIC設定を使って各視野の焦点を継続的に確認し(不要な光漂白を防ぐため)、セルが時間とともにピントが合わない傾向があるため、ポイントリストの情報を再フォーカス・更新してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	フィッシャー・バイオリエージェント	BP160-100	分子生物学グレード - 低EEO
FM4-64	インビトロジェン	T3166	顕微鏡
ガラス製ボトムディッシュ	マットテック	P35G-1.5-14-C	顕微鏡
顕微鏡	GE	デルタビジョン・エリート	カスタマイズされたオリンパスIX-71逆立顕微鏡スタンド;カスタム照明塔と透過光照明モジュール。対物レンズ:PLAPON 60X(N.A. 1.42、WD 0.15 mm);OLY 100Xオイル(N.A. 1.4、WD 0.12 MM);100XオブジェクティブのDICプリズム・ノマルスキ;CoolSnap HQ2カメラ;SSIアセンブリー7色;環境制御チャンバー - 不透明。
PC190723	ミリポーアシグマ	3445805MG	FtsZ阻害剤
ソフトウォークス	GE		メーカー提供のイメージングソフトウェア