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動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 尾静脈注射によるマウスへのリステリア・モノサイトゲネス接種および肝臓、脾臓、心臓内の細菌負荷の評価
注: すべての動物実験はCDCのバイオセーフティレベル2ガイドラインに従って実施されます。マウスは通常1週間前に注文され、1ケージに5匹の動物と一緒にケージに入れられます。マウスは注射前に4日間新しい実験室環境に慣れるまで待っています。これらの実験は、6〜8週齢のメスのスイスウェブスターマウスを、5匹ずつケージに隔離し、制限のない食事を与えたものでした。
- 蓋と餌・水の容器を外して、ケージを5分間ヒートランプの下に置いて一羽ずつ準備します。この過程により尾の静脈が拡張され、注射が容易になります。
- 1頭の動物を取り出し、ハーネス(または端を切り落としたファルコンチューブ)に装着して、注射中に動物を拘束します。
- 注射部位をアルコールパッドで洗浄し、アルコールを蒸発させます。これにより部位が浄化されるだけでなく、尾動脈もさらに拡張されます。
- 27.5ゲージの針を装着した1mlの注射器を使い、目的の培養液200μlを尾の静脈に優しく注入します。
- 注射による出血を防ぐためにガーゼを使用し、動物を新しいケージに入れてください。
- このプロセスを残りの動物や系統にも繰り返します。動物の各ケージには、受けた品種を必ずラベル付けしてください。
- 毎日動物の様子を確認し、病気と思われる動物は取り除き、生贄にします。動物に病気の兆候が見られない場合は、感染を72時間進行させてからすべての動物を犠牲にしてください。
- 生贄としては、すべての呼吸が止まるまでボトル入りのCO2 麻酔を使い、その後頸椎脱臼術を使って動物が確実に死んでいることを確認します。
- 生贄の後、動物を組織培養フードに移して解剖します。
- 解剖ブロックを使い、動物の各脚を太い針で固定し、70%エタノールをスプレーして飽和させます。
- 膣口から歯突起まで伸びるY字型の切開で腹部と胸部の皮膚を切り取り、そこから両腕の腋窩まで進みます。
- 皮膚を引き戻し、両脚の針を抜いて解剖を開いたままにします。
- 腹膜を優しく切り、腸、胃、肝臓、脾臓を露出させます。
- まず肝の上部にある肝静脈と冠状靭帯を切断し、肝臓の摘出を始めます。除去すべき追加の靭帯は肝臓の下にあり、肝臓を小腸の第一部分や背中の筋肉とつなげています。
- 肝臓を50mlのファルコンチューブに5mlの滅菌DDH2.0に入れます。
- 次に、脾臓を隔離し、血管や靭帯を優しく切除して除去します。脾臓は肝臓よりも容易に切除されます。脾臓を5mlの滅菌ddH20を含む別のファルコンチューブに入れます。
- 横隔膜を見つけて肋骨に沿って優しく切り、胸部を視覚化します。剣骨突起と胸骨を首の高さまで切り開き、胸を開けて心臓と肺を露出させます。
- 鉗子を使って心臓の先端を優しく掴み、大動脈と肺血管が張力を持つように持ち上げます。心臓を解放するためにこれらの血管を切り開け。
- 心臓を50mlのファルコンチューブに入れ、5mlの滅菌DDH2.0を入ります。
- マウスの死骸は廃棄し、各臓器ごとに5mlの滅菌DDH2.0を含む清潔なファルコンチューブを使って、すべての動物にこのプロセスを繰り返します。
- すべての臓器を取り除いた後、作業台を清掃し、作業台に戻ってください。
- 5匹のマウスの臓器ごとに均質剤の洗浄と滅菌に使う5本のチューブを準備します(肝 臓5本用5管セット、脾臓5本用5管、心臓5本用5管)。各チューブ4本は30mlの滅菌DDH2.0を充填し、1本は30mlの90%EtOHを充填してください。
- TissueMaster(または同等のホモジナイザー)を使い、ホモジナイザーを(運転しながら)ステップ1.21で準備したチューブに浸し、プローブを洗浄します。
- チューブ1(ddH2O)チューブ2で5秒(ddH2O) チューブ3(EtOH)で5秒 チューブ4(ddH2O)で5秒 チューブ5(ddH2O)
- 均質化剤を使って1つの肝臓を少なくとも2分間均質化し、臓器の目に見える部分がなくなるまで続けます。ピンセットを使ってプローブの大きなゴミを取り除きます。
- 説明した洗浄プロセスを繰り返します。
- 他の肝臓でも均質化プロセスを繰り返し、前述の方法で各肝臓間でプローブを洗浄するようにしてください。
- すべての肝臓が完全に均質化されたら、肝臓用の洗浄チューブ(1〜5)を捨てます。
- 脾臓と心臓の両方についても同じように均質化・洗浄のプロセスを繰り返し、各臓器ごとに新しい洗浄チューブを使うようにしてください。もしウォッシュチューブが濁ったら、廃棄して新しいチューブに交換してシリーズを完成させます。
- すべての臓器が均質化されたら、ホモジナイザーで最後の洗浄サイクルを行い、保存のためにしっかり乾燥させます。
- 各臓器の約200μlを96ウェルプレートの個別ウェルに配置します。
- 臓器サンプルに対して連続希釈を行い、肝臓と脾臓で最大1:10,000希釈、心臓で最大1:1,000の希釈を行います。
- 希釈系譜を事前に温めたLB寒天にスポットプレートします。また、希釈されていない臓器とプレートをそれぞれ20 ulずつ除去し、不十分なコロニーの臓器からCFUを列挙します。
- 均質化された臓器を含むファルコンチューブは廃棄し、希釈系列を含む96ウェルプレートをパラフィルムで包んで-80°Cの冷凍庫に入れます。
- シミを乾かします。この作業は、プレートをフードに置き、蓋を外すことで加速されます。
- 斑点が乾いたら、プレートを37°Cのインキュベーターに一晩入れます。
- 翌朝、各部位の菌株数を数え、希釈数を使って臓器ごとの細菌総数を計算します。