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動物サンプルを含むすべての手続きは、適切な動物倫理審査委員会によって審査・承認されています。
1. 感染
- 生後10〜12週の間に男女ともBALB/cマウスを入手してください。
注: 肺炎連鎖球菌 血清型4株TIGR4は、解析されている病原性の高い臨床分離株です。 - TIGR4をトッド・ヒューイットブロスで37°C、5%CO2 で培養し、培養が620 nm(OD620)で0.5(1.0 ×10 8 コロニー形成単位[CFU]/ml)に達するまで培養します。肺炎球菌培養液を3,500 × gで遠心分離10分間し、真空ラインで上清液を除去します。細菌を無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で懸濁・希釈し、最終濃度1.0 ×10 4 CFU/mlにします。
- 誘導チャンバーを用いて、酸素中に2.5%の汽化イソフルランでマウスを麻酔します。鈍いピンセットで優しくつまんで麻酔状態を確認してください。
- 麻酔を受けたマウスを片手で首根を掴み、直立させて、27-30ゲージの針(チャレンジ用量1.0×103 CFU)を注射し、各マウスに100μlの肺炎菌懸濁液を腹腔内(同例)注射します。ネズミをケージに戻してください。マウスは通常、注射後30〜40秒で目覚めます。
- 感染を少なくとも24時間(初期)または30時間(進行)して待ってください。
- マウスをCO2窒息で安楽死させる。マウスが死亡していることを確認するために子宮頸椎脱臼を行います。安楽死はステップ1.6で心臓の摘出によってさらに確認されます。
- 尾をアルコール綿棒で消毒し、2〜3mmの断片を切り取ります。血液2μlを採取し、ナトリウムヘパリン1 U/mlを含むPBSを10倍に連続的に5回希釈します。トリプティック大豆血液寒天プレートに連続希釈をプレートし、5% CO2で37°Cで一晩培養します。翌日、コロニーから細菌血症のレベルを数えて外挿します。
- マウスを手術台の上で仰向けに固定します。胸に70%エタノールをスプレーして軽く拭き取ってください。外科用はさみと鉗子を使い、胸腔を開け、肋骨を取り外し、横隔膜を切断して心臓と肺を露出させます。ハサミを使って心臓に繋がる血管を切り、ピンセットであざができないように慎重に心臓を切除します。
- 心臓をPBSで洗浄し、組織標本収集カセットに入れて、組織切片時に冠状切片を行うようにします。パラフィン埋め込みの場合は、カセットを10%のバッファーホルマリン溶液に浸し、翌日にパラフィン埋め込みに送ります。
- または最適切断温度(O.C.T.)を用いた急凍も可能です。ドライアイスの上に置かれたクリオモルドの中の化合物。
2. 病変内の心臓病変および肺炎球菌の可視化
- パラフィンが埋め込まれた心臓切片を切り取り、各組織切片で心臓の4つの腔室が見えるようにします。スライドは厚さ5μmでカットします。
- 標準的な方法でヘマトキシリンとエオシン(H&E)で脱硫および染色スライドを行います。
- 光学顕微鏡を使った低倍率(100×、200×)と高倍率(油浸し:400×、1,000×)でH&E染色された心臓切片を観察できます。心臓の心筋に微小病変の有無を特徴付けます。ここでは、100×1.3の数値絞りPlan-NEOFLUAR対物レンズを搭載したZeiss Axioskop 2顕微鏡を用いてH&E画像を取得します。
注: 初期段階では、心臓病変は異なる色の外観や、場合によっては単球のように見える免疫細胞(モノサイトや顆粒球)の存在によって識別されます。進行した病変、特に30時間で見られる病変では免疫細胞が存在せず、その代わりに大きな液胞状病変が観察されます。心臓病変の初期段階で免疫細胞の流入が起こり得ることはあるものの、必須条件とはならないことに注意が必要です。
3. 微小病変内の肺炎球菌に対する免疫蛍光顕微鏡法
- ミクロトームで5μm厚のクライオモールドで心臓を切開し、正に帯電したガラススライドに切片を置きます。凍結した心臓切片は解凍して自然乾燥させます。10%中性緩衝ホルマリン(pH 6.8-7.2、25°C)で10分間区画を固定します。
- PBSでスライド(3×)を5分間洗い、0.2%のTriton X-100で15分間透過し、その後再度PBSで洗います。
- PBSで10%ヤギ血清を用いてスライドの組織切片を1時間ブロックします。
- PBSでスライドを洗浄し、覆いをして心臓切片を1:1,000のPBSで10%ヤギ血清と10%ヤギ血清を2時間、37°Cで培養します。
注: 陰性対照については、純真ウサギ抗血清を使用すべきです - PBSで洗浄した後、10%ヤギ血清-PBSとヤギ抗ウサギ蛍光素イソチオシアネート(FITC)共役抗体を1:2,000で37°Cで30分間、30分間カバーして培養します。
- 製造元の指示に従い、真核核の可視化にはDAPI(4',6-Diamidino-2-フェニリンドール)を5 mg/mlで使用してください。組織切片はFluorSaveで洗浄し、取り付けます。
- 共焦点顕微鏡システムを用いて、低倍率および高倍率の両方で蛍光画像を取得します。最適な結果を得るために数値絞りを調整してください。ここでは、60×1.42の数値絞り対物レンズを持つ共焦点システムで蛍光画像を取得します。