濃縮されたハエサンプルからの食中毒病原体のPCR検出

要約

出典:Pava-Ripollら。個々の汚れたハエから食中毒の細菌病原体を検出。J. Vis. Exp.(2015年)

この動画では、病原体特異的タブレットを用いて濃縮されたハエサンプルから標的細菌DNAを増幅するPCRベースの方法を示し、リアルタイムの蛍光検出と融解曲線解析を行い、個々の昆虫における食中毒病原体の存在を確認できます。

プロトコル

1. ハイドレートPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)-レディタブレット

1. 冷却された(4°C)PCR冷却ブロックを選び、インサートの上にPCRチューブラックを置きます。
2. ターゲット食中毒原体のPCR対応錠剤(各キットに付属)を含む対応するPCRチューブを、ラックファイルに従ってホルダーに配置します。
3. デキャッピングツールを使って、PCRチューブのキャップを慎重に外してください。キャップを外して、各チューブにタブレットが入っているか確認してください。
4. 50μl( サルモネラ 菌および クロノバクター用)または30μl( L. monocytogenes)を特定のPCRチューブに移管します。新しい光学キャップを使い、キャッピングツールでPCRチューブにしっかりと固定してください。
   注: 溶解液をPCR対応型タブレットに加えた後、サンプルは2〜8°Cで冷却され、PCR検出システムにロードされるまで保管しなければなりません。PCRチューブは2,500×gで数秒間遠心分離し、チューブの底部に全体積が収まるようにします。
5. PCRチューブをPCRサイクラー/検出システムの機器に装填するには、機器の引き出しを開けて行います。
6. PCRチューブのラックを引き出しのウェルに入れ、チューブが正しく装着されているか確認してください。
7. 引き出しを閉じて、メーカーのプロトコルに従ってプログラムを開始します。
   注: PCRベースのこの装置は、各食中毒病原体ごとにあらかじめ設定されたサイクルパラメータを備えています。
8. PCRサイクル状態バーに青いバーが表示され、増幅部分が稼働していることを確認しましょう。
   注: 標準的なPCRアッセイでは、プログラム全体の処理時間(増幅と検出)は約3〜3.5時間かかります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
キャップツール	デュポン	D11677028
デキャップツール	デュポン	D11134095
PCRチューブラック/ホルダー	デュポン	D12701663
細かい先端のストレートチップ鉗子	バイオクイップ	4731	使用前に必ず消毒してください。複数のサプライヤー。
冷却ブロック			複数のサプライヤー。
遠心分離機			複数のサプライヤー。