表面誘発細菌病原性をスクリーニングするための迅速画像ベースのアッセイ

要約

出典: ペリンバム、K.、シリャポーン、A.アメーバを用いた迅速画像ベースの細菌病原性アッセイ。 J. Vis. Exp. (2018年)

本ビデオでは、アメーバを表面付着またはプランクトニック細菌と培養し、カルセイン-アセトキシメチルエステル(カルセイン-AM)アガロースパッドを適用し、蛍光をイメージングして宿主細胞の損傷を検出することで、細菌の病原性を評価する迅速な画像ベースの方法を示します。

プロトコル

1. 顕微鏡 - 寒天パッドの調製

1. アメーバが準備できる約30分から1時間前に寒天パッドを準備し、緑 膿菌と混合します。
2. 250mLフラスコに1%(w/v)寒天を50mLのマイクロ波で加熱し、開発バッファー(DB)を置きました。20秒ごとに混ぜて寒天の塊が消えます。
3. 溶けた寒天を予熱した55°Cの水槽に15分間入れて冷ます。
4. カルセインAMストック溶液15 μLを円錐形のチューブ内の溶融寒天15 mLに加えます。チューブを優しく4〜5回逆さまにして混ぜ、すぐに次のステップに進みます。
   注: この工程はポリプロピレン15mL遠心分離機管内で行います。厚いガラス容器は使わないでください。寒天が早く固まりすぎてしまいます。
5. 溶融した寒天混合物を12cm×10cmのガラス板の上に注ぎ、室温で10分間固まらせます。固まった寒天パッドを印刷されたグリッドの上に置き、金属定規でグリッドに沿って切って、固まった寒天パッドを1.5cm×1.5cmの小さなセクションに切ります。
6. ジェルは湿った箱で水分を保ち、使用可能になるまで保ちましょう。

2. 顕微鏡法 - 細菌-アメーバサンプルの画像作成

1. 表面付着細菌細胞の病原性を測定するために、表面付着細菌に10μLのアメーバ細胞を加えます。
   注: このステップはアメーバと細菌の混合について説明します。
2. プランクトニック細胞の病原性を測定するために、アメーバ細胞10μLとプランクトニック細菌10μLを混ぜます。
   注: アクセン培養アメーバ細胞(OD₆₀₀ 0.2〜0.5)を細菌と混ぜる前に洗浄しないでください。抗生物質-抗菌液の使用により、アメーバ培養では大 腸菌 の増殖は観察されません。
3. すぐにステップ1.5の1.5cm×1.5cmのカルセイン-AM寒天パッドを、ペトリ皿の表面にある細菌とアメーバの混合物の上に置きます。
   注: アガーパッドを素早く滑らかな動きで混合物の上に置きます。パッドをゆっくりと混合物の上に下げないでください。この動きは細胞をパッドの裏側から遠ざけて周辺に押し上げる傾向があります。この工程により、細菌とアメーバが均等に混ざり、固定され、両細胞が同じ平面に閉じ込められるようにします。
4. 寒天パッドの周囲に残った液体を優しくピペットで除去して余分な液体を取り除きます。ペトリ皿を室温で20分間乾燥させます。
5. ペトリ皿に蓋をし、固定したアメーバと細菌の混合物を室温でさらに40分間培養します。ステップ3.1に進みます。
   注: 背景蛍光が時間とともに増加するため、すべてのサンプルを同じ時間で培養することが重要です。孵化時間は1時間が推奨されます。1時間を超える潜伏は再現性が低く、アメーバ細胞が破裂し始める可能性があります。

3. 顕微鏡 - 画像取得

1. 明視野および緑色蛍光画像を取得可能な蛍光顕微鏡を用いたアメーバの画像化。緑色蛍光には、励起と放出にそれぞれ474/27 nmと525/45 nmの緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルターを使用します。10倍(≥0.3の数値絞り)の対物レンズを使ってアメーバを撮影してください。
   注: 寒天中のカルセイン-AMは、死にかけたアメーバに緑色蛍光チャネルで蛍光を発させます。健康なアメーバはそれ以外は蛍光を発しません。
2. 位相差やGFPチャネルの取得時間を調整し、光毒性を抑え、画像強度のダイナミックレンジを最適化します。必要に応じて差分干渉コントラスト(DIC)位相差を置き換えます。
   注: 可能であれば位相差とGFP蛍光のために100〜200msの露光を用いてください。実験中は露光と計器の設定を変えずにいてください。これはホストキリングインデックスの計算に不可欠です。
3. 宿主殺害指数の計算に良い統計を得るために、少なくとも100個のアメーバ細胞の画像を取得してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
バクト寒天、脱水	BDディフコ	214010
抗生物質・抗菌薬(100倍)	ライフ・テクノロジーズ	15240062	1 mL<アリコートし、-20°Cで保存します
カルセイン-アセトキシメチルエステル(カルセイン-AM)	ライフ・テクノロジーズ	C34852	カルセインアセトキシメチル(AM)
塩化カルシウム、無水	シグマ・オルドリッチ	C1016
D-グルコース	フィッシャー・ケミカル	D16500	デキストロース
ジメチルスルホキシド	シグマ・オルドリッチ	D5879
葉酸	シグマ・オルドリッチ	F8758
LB-ミラー	BDディフコ	244620
塩化マグネシウム	シグマ・オルドリッチ	M8266
酵母抽出物	オキソイド	LP0021
特殊ペプトン	オキソイド	LP0072
水酸化カリウム	フィッシャー・ケミカル	P250
リン酸カリウム一塩基性	シグマ・オルドリッチ	P0662
リン酸ナトリウム二塩基性七水和物	フィッシャー・ケミカル	S373
ビタミンB12	シグマ・オルドリッチ	V2876
系統
ディクティオステリウム・ディスコイデウム	シリャポーン研究所	ストレインAX318
大腸菌	シリャポーン研究所	ストレインB/r17
Pseudomonas aeruginosa	シリャポーン研究所	PA14	PA14ストレイン19
緑緑膿菌 ΔlasR	シリャポーン研究所	AFS20.1	PA14由来型s20
物資
0.22μmフィルター	ミリポール	SCGPT01RE	フィルター滅菌のために
円錐形チューブ、15 mL	コーニング	352097
ガラス保存ボトル	パイレックス	13951L	250 mL、500 mL、1000 mL
ペトリ皿、直径6 cm	コーニング	351007	60×15mmのポリスチレンプレート
ペトリ皿、直径10cm。	フィッシャー	FB0875712	100 x 15 mmのポリスチレンプレート
蓋付きのプラスチック容器	ジップロック	2.57E+09	四角い3カップ容器
ガラス板	バイオ・ラッド	1653308	寒天パッドの準備用です。同様の寸法の他のガラス板も使用されることがあります。
木製の棒	フィッシャー	23-400-102
装備
エクリプスTi-E顕微鏡	ニコン	MEA53100	顕微鏡のセットアップ
10X プラン フルオリウム Ph1 目的物 0.3 NA	ニコン	MRH20101	顕微鏡のセットアップ
蛍光励起源	ルメンコア	ソラライトエンジン	顕微鏡のセットアップ
蛍光フィルターセット	セムロック	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	顕微鏡のセットアップ
Orca フラッシュ 4.0 V2 カメラ	浜松	77054098	顕微鏡のセットアップ
イメージJ	NIH	第1巻49節	画像解析用ソフトウェア
MATLAB	数学作品	R2013	画像解析用ソフトウェア
軌道シェーカーインキュベーター	VWR	89032-092	37°Cでの細菌増殖用
プラットフォームシェーカー	フィッシャー	13-687-700	22°Cでのアメーバの成長のために
分光光度計	バイオクロム	ウルトロスペック10
アンダーカウンター冷蔵インキュベーター	フィッシャー	97990E	22°Cでのアメーバの成長のために
等温水浴	フィッシャー	15-462-21Q	55°Cまでの冷却媒体用