感染研究のためのマウス脾臓における細菌負荷の評価

要約

出典: Mendspacher, J. H. および Fessler, M. B.マウスにおける実験的な細菌性肺炎の誘導および表現型解析のための非侵襲的かつ技術的に非集中的な方法です。 J. Vis. Exp. (2016年)

この動画は、感染マウスの脾臓内の細菌負荷を定量化し、感染の重症度を評価する過程を示しています。均質化された脾臓は連続的に希釈され、プレート処理されて総細菌負荷を測定します。得られるデータは、全身組織内の宿主-病原体の相互作用に関する洞察を提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 口咽頭からのクレブシエラ肺炎の小鼠気管内吸引

1. ネズミは尾のマークやタトゥー、その他の承認された識別子で一意に識別されていることを確認してください。
2. イソフルランからマウスを除去する前に、P200ピペットで細菌の投与接種を抽出し、手順を迅速化します。iT吸引の最良の結果を得るには、溢れを防ぐために<100μlの容量を使用してください。ここで、2000コロニー形成単位(CFU)/50μlの 肺炎菌を使用します。
3. マウスは透明なチャンバーでイソフルランガス(例:2%イソフルラン、流量1L/min)または機関のガイドラインに従って麻酔します。一緒に麻酔をかけるマウスの数は実験者の快適さによって決まり、通常は1〜2匹ずつです。呼吸を観察し、深呼吸が見えたら麻酔のレベルを確認し、呼吸の間に2〜3秒の間隔を数えます。注: 揮発性(吸入型)麻酔薬の交絡作用が懸念される場合は、ケタミン/キシラジンの腹腔内注射で麻酔を得ることができます。上記の方法では、深麻は数分しか持続しません。より長時間の麻酔が誘発された場合は、眼の乾燥を防ぐために眼軟膏を使用するべきです。
4. 麻酔が終わったら、マウスを半横に仰向けにして、上顎切歯で輪ゴムでピンの間に伸ばした傾斜したプレキシガラス板に吊るします(図1)。
5. 鈍く溝のない鉗子でマウスの舌をそっと横に引っ張り、P200ピペットで口腔内に投与します。舌や口咽頭に外傷を与えないように細心の注意を払ってください。
6. 舌を引っ込めたまま、手袋をした指で鼻を優しく塞ぎ、ネズミが吸い込むまで待ちます。マウスが2回以上吸い込み、口腔内に液体が見えなくなるまで鼻を覆い続けます。鼻を覆うことで、マウスは鼻呼吸が強いため、ネズミが細菌を肺に吸い込むのを防ぐことができます。
7. ネズミを接種ボードから外し、ケージに戻し、麻酔回復中に寝床やゴミが鼻孔を塞がないように仰向けに置きます。
8. すべてのマウスが投与され麻酔から目覚めたら、 K. pneumoniae を投与されたマウスだけが入った個室やキュービクルに飼育します。感染後48時間を超える場合は、体重を含めて毎日マウスを監視してください。
9. マウスが48時間以上放置する場合は、毎日マッシュ(マッシュ)や補助加熱を使いましょう。

2. 肺および末梢組織における細菌負荷の測定

1. 開始前に、肺と脾臓用に1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)900μl、血液用に1xPBS90μlの希釈チューブを準備します。細菌培養用のラベルプレートを室温でセットします。したがって、組織が採取された後は、均質化から細菌増殖までの時間を最小限に抑えられます。
   注: 誤嚥時に肺に細菌が異質に沈着するため、全気道細胞量または全(両側)肺細菌負荷の解析には個別マウスを使用することが推奨されます。
2. 施設のガイドラインに従ってマウスを安楽死させてください。ここでは、150 mg/kgのペントバルビタールナトリウムまたは同等量の市販安楽死溶液の致死注射を用い、その後大量出血を施します。これにより、_CO2 吸入や頸椎脱臼に伴う肺への合併症を回避できます。
3. 脾臓を取り出し、1xPBSを2mlに入れます。チューブを氷の上に置く。各組織やマウスの間にエタノールで器具を洗い込むことに注意してください。
4. 組織は氷上で均質化し、できればサンプルごとに交換可能な使い捨てホモジナイザーで行うのが望ましいです。使い捨てホモジナイザーの先端は実験間に再利用するために自動滅菌処理可能です。
5. 組織が均質化されたら、連続希釈とプレートを行います。特定の組織や希釈物のサンプルを、単一のトリプティック大豆寒天(TSA)プレートに分割線を引いて二重にプレートサンプルを採取します。プレートおよび希釈の提案は以下の通りで(すべてのケースで10μlのサンプルがプレートに広げられています)、感染後24時間の検死に基づいています。48〜72時間のサンプルを分析する場合、後期の細菌負荷増加により、より多くの希釈剤をプレート化する必要がある場合があります
   1. 脾臓については、均質脾臓100μlを無菌1xPBS900μlに連続添加して1:10〜1:100で希釈します。均質を整え、両方の希釈を重複してプレートします。
6. スプレッドサンプルを短時間乾燥させます。
7. TSAプレートを逆さにして、静止した37°Cのインキュベーターに一晩入れます。
8. プレートの両面および各希釈による細菌群落の平均を取って、定着菌の数を算出します。肺に5ml、脾臓に2mlの初期希釈を加え、全組織CFUを算出します。

結果

図1:マウス誤嚥性肺炎の処置掲示板。 研究用マウスは頭を上にして背中をボードに向け(すなわち半横たわり)、前歯で2つのペグの間に伸ばされたゴムバンドに吊るされ、プレキシガラスや類似の板に取り付けられています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ATCC	43816
ベクトン・ディッケンソン	211825
社内で準備	該当なし	蒸留水(5リットル)、ナチュラル酸塩(40 g)、ケイロキ酸(1 g)、ナジエス・ハイポロ(5.75 g)、キノキ酸二ポリス(1 g)