感染マウスの腸組織におけるアミノ酸代謝物の可視化

要約

出典: スペッカー、J. T.、 他感染時に寒天および組織上で培養された細菌コロニーの質量分析による微生物協力の調査。 J. Vis. Exp. (2022年)

このビデオは、クロス トリジオイデス・ディフィシルに感染したマウスの腸組織内のアミノ酸分布を単独または Enterococcus faecalisと組み合わせて、マトリックス支援レーザー脱着・イオン化(MALDI)質量分析法を用いて可視化する方法を示しています。この手順は、組織の準備、マトリックスの塗布、レーザーイオン化、アミノ酸イオンの検出を含み、空間イオン画像を生成することを指します。結果は、 E. faecalis がオルニチンを放出しアルギニンを枯渇させることで腸内環境を変化させることで、C . difficile の病因を増加させることで微生物の協力関係を示している。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 非感染対照群およびC. difficile感染マウスの盲腸組織の調製および輸送
   1. 生後4〜8週齢のC57BL/6オスマウスに抗生物質(0.5 mg/mLセフオペラゾンまたは0.5 mg/mLセフォペラゾン+1 mg/mLバンコマイシン)を飲料水で自由 に 5日間接種し、その後2日間の回復期間とその後の感染を経ます。
   2. 動物を_CO2 窒息で安楽死させ、マウスの盲腸器官を即座に採取してください。蒸留水に最適切削温度(OCT)化合物の20%混合物を埋め込む。
   3. サンプルをドライアイスに置き、その後梱包して分析のために輸送します。分析まで-80°Cで保存します。

 

2. 非感染対照群とC. difficile感染マウス盲腸組織の冷凍切房

1. すべてのクライオセクション機器は100%エタノールで洗い流し、乾燥させた後にサンプルをクライオスタットチャンバーに入れてください。導電性コーティングのあるスライドの側面を特定するためにオームメーターを用いて、ITOコーティングされた顕微鏡スライドを準備します。ダイヤモンドチップのスクライブを使って、ITOコーティングされた顕微鏡スライドの側面にエッチングとラベルを付けます。
   注: 手袋、実験用メガネ、白衣、クライオスタットスリーブなどの適切な個人用防護具を着用してください。
2. 研究用クリオマイクロトームでクリオセクシングを行います。OCT埋め込みマウスセカ組織を-80°Cの冷凍庫からクライオマイクロトームチャンバー(チャンバー温度30°C、物体温度-28°C)にドライアイスで移します。比較対象の組織サンプルを、画像質量分析(例:感染していない対照群と C.ディフィシル感染の比較)を用いて同じ顕微鏡スライドに取り付け、両組織のサンプル準備が同一になり、正確な代謝物比較を可能にします。
3. クライオマイクロトームチャンバー内で、OCT埋め込み組織を追加のOCT溶液を使ってサンプルチャックに取り付けます。OCT溶液が固まったら、チャックを試料ヘッドに固定します。10〜50μm単位で凍結解剖を開始し、所望の組織深度や面に到達します。
4. 最適な断面に到達したら、厚さ12μmの断片の採取を開始します。アーティスト用のペイントブラシでスライスを優しく加工し、テフロンコーティングされた顕微鏡スライドに置きます。
5. ITOコーティングされた顕微鏡スライドを組織断片の上に転がして、テフロンコーティングされたスライドから組織を取り上げます。融解後、組織断片をITOコーティングされたスライドの背面に手のひらを押し当てて顕微鏡スライドに取り付けます。組織の部分が半透明から不透明/マットなテクスチャーに移行するまで、マウントを解凍し続けます。
6. 組織装着顕微鏡スライドをドライアイスの上で移し、乾燥剤入りのドライボックスに移して当日分析用に保管するか、-80°Cで長期保存します。

3. マトリックス適用およびMALDI質量分析のための非感染対照群とC. difficile感染マウスの盲腸組織の準備

1. MALDIマトリックス塗布(ノズル温度30°C、8回通過、流量0.1 mL/min、CCパターン、乾燥時間0秒、10 psi)を実施。
2. MALDIイメージング質量分析の実施
3. 複数の生物複製からのイオン画像を解析し、上記のSCiLS統計ソフトウェアを用いて強度ボックスプロット 比較で 有意性を比較します。
   注: 適切な統計的検定や比較は応用分野により、空間的セグメンテーション、分類モデル、比較分析などが含まれ、識別的かつ相関のあるスペクトル特徴を決定することが可能です。比較分析には、重要な特徴に p値を割り当てること、組織比較のための主成分分析の作成、変異を特定するためのボックスプロットの可視化などが含まれます。また、画像質量分析後にヘマトキシリンおよびエオシン(H&E) で 染色した組織断片の明視野顕微鏡を用いて組織を可視化することも有用です。これにより組織の形態的特徴を明確に特定でき、訓練を受けた病理医と相談して分析することが可能です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 μm Titan3ナイロンシリンジフィルター	サーモ・サイエンティフィック	42225-NN
1,5-ジアミノナフタレンMALDIマトリックス	シグマ・オルドリッチ	2243-62-1
20mL Henke Ject ルアーロック注射器	ヘンケ・サス・ウルフ	4200.000V0
275iシリーズ対流真空計	カート・J・レスカー社	KJL275807LL
スマートビームII Nd:YAG MALDIレーザーシステム(2 kHz、355 nm)を搭載した7T solariX FTICR質量分析計	ブルーカー・ダルトニックス
HPLCに適した酢酸溶液	シグマ・オルドリッチ	64-19-7
アセトニトリル、HPLCに適し、勾配グレード、≥99.9%)	シグマ・オルドリッチ	75-05-8
水酸化アンモニウム溶液、水2Oに28%のNH3、≥99.99%微量金属ベース	シグマ・オルドリッチ	1336-21-6
オートクレーブ可能なバイオハザードバッグ:55ガロン	グレンジャー	45TV10
バイオハザード標本輸送バッグ(8×8インチ)	フィッシャー・サイエンティフィック	01-800-07
脳心臓注入スープ	BDバイオサイエンス	90003-040
C57BL/6オスマウス	ジャクソン研究所
CanoScan 9000F Mark II 写真および文書スキャナー	正史
CM 3050S研究用クライオミクロトーム	ライカ・バイオシステムズ
乾燥器キャビネット	シグマ・オルドリッチ	Z268135
ダイヤモンドチップスクライブ、電子顕微鏡科学	フィッシャー・サイエンティフィック	50-254-51
乾燥石乾燥剤ペレット	ドライエライト	21005
エタノール、200プルーフ	デコン・ラボ	2701
flexImaging ソフトウェア	ブルーカー・ダルトニックス
ftmsControlソフトウェア	ブルーカー・ダルトニックス
ガラス製真空トラップ	シグマ・オルドリッチ	Z549460
HTX M5 TMロボットスプレーヤー	HTXテクノロジーズ
インジウムスズ酸化物(ITO)コーティング顕微鏡スライド	デルタ・テクノロジーズ	CG-81IN-S115
真空ポンプへの直列HEPAフィルター	ラブコンコ	7386500
メタノール、HPLCグレード	フィッシャー・ケミカル	67-56-1
MTPスライドアダプターII	ブルーカー・ダルトニックス	235380
最適切削温度(OCT)化合物	フィッシャー・サイエンティフィック	23-730-571
Peridox RTUの害虫剤、消毒剤、クリーナー	コンテック	CR85335
PTFE(テフロン)プリントスライド、電子顕微鏡科学	VWR	100488-874
ロータリーベーン真空ポンプ RV8	エドワーズ	A65401903
ティッシュテック Accu-Edge 使い捨てハイプロファイルミクロトームブレード	電子顕微鏡科学	63068-HP
透明な真空管	コール・パーマー	EW-06414-30
ウルトラグレード19バキュームポンプオイル	エドワーズ	H11025011
可変電圧トランス	パワースタット
HPLCに適した水	シグマ・オルドリッチ	7732-18-5
ワイドマウスのデュワーフラスコ	シグマ・オルドリッチ	Z120790