Bacillus subtilisにおけるペリクル形成に対する阻害剤の効果評価

要約

出典:Bucher, T.ら。B. subtilisバイオフィルムを小分子バイオフィルム阻害剤の特性評価モデルとして研究する方法。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、 Bacillus subtilis を用いたペリクル形成アッセイを実証し、マトリックス合成やバイオフィルムの発生を妨げる小分子阻害剤を評価し、浮遊細胞に影響を与えずに表面関連の成長を選択的に阻害する化合物をスクリーニングするモデルを提供します。

プロトコル

1. 小分子阻害剤がペリクルおよびバイオフィルムコロニー形成に与える影響の評価

1. 塩化カルシウムと塩化鉄(III)六水和物を含まない、定義されたバイオフィルム誘導MSgg(グルタミン酸ナトリウムグリセロール)培地を2倍溶液準備します。ろ過滅菌後、塩化カルシウムを加えます。培地は直接使用可能で、暗闇で4°Cの温度で保存することも可能です。
2. 実験当日に1倍のMSgg希釈を準備してください。
   1. MSgg培地2倍を滅菌蒸留水(ペリクル)または無菌3%の高温(80°C)寒天(バイオフィルム)で希釈し、最終濃度50μM(ペリクル)または250μM(バイオフィルム)に塩化鉄(III)六水和物を加えます。抗生物質や小分子阻害剤を希望の濃度に加え、よく混ぜます。例えば、30 mlで0.5 mMのD-ロイシン濃度を最終的に得てペリクルやバイオフィルムを形成するには、76.3 mM(10 mg/ml)のD-ロイシンストック溶液196.6 μlを加えます。
      注: 最終的な1xのMSgg組成は 表1に記載されています。元のレシピと比べて、培地には50 μg/mlのスレオニンが含まれており、固体MSgg培地上でバイオフィルムコロニーを成長させるための鉄の濃度は2.5倍に増加し、しわの形成されたコロニー形態を最適化しました。
3. 寒天が固まった後、固体のMSggプレートを生物フードで30〜45分間乾燥させてから接種します。
4. ペリクル形成のメカニズムを妨げる特定の阻害剤を選択するために(図1)、使用される濃度がプランクトン成長および静的成長に影響を与えることを除外します。
   1. プランクトン成長(液体培養中の光学密度の増加)を、静止成長相まで毎時間600 nmの光学密度を測定することで、単純な成長曲線で測定します。
   2. 測定された培養濁度が生細胞数を表すことを確認するために、複数の時点で振動培養からプランクトン成長期のコロニー形成単位(CFU)数を決定します。
   3. 小分子阻害剤が静的なペリクル成長に与える影響を評価するために、24ウェル培養ウェルから23°Cで3日間の培養終了時に細胞を採取し、1.7-1.9節で説明された条件で接種し、CFUを決定します。この制御には、細胞外マトリックス成分をコードするオペロン(例:B. subtilis ΔepsH、ΔtasA)を欠失したペリクル欠損株を使用します。
      注: この品種は静的な条件下でも成長可能ですが、ペリクル形成型とは異なり、酸素濃度の増加により成長が促進される液体-空気界面への浮遊能力が不足しています。したがって、この細胞外マトリックスおよびペリクル欠損株は、静的条件下での成長を評価するための推奨される参照株です。
      注: 以下に述べる非標準的なD-アミノ酸D-ロイシンの具体例では、ペリクル形成を妨げる濃度でのプランクトン成長や静的成長への影響は除外されました。プランクトン成長および静的成長を決定する方法を詳細に説明しています。
5. B . subtilis は-80°Cのストック(20%グリセロールに凍結した10個^の9 細胞/mlのLB培養)からストリークし、無菌の先端またはアプリケータースティックを用いてLB-1.5%寒天プレート上で単一コロニーを分離します。
6. 30°Cで一晩育てます。
7. 重要なステップ: D-ロイシンなどの非標準的なD-アミノ酸による強力なペリクル阻害のために、LB-1.5%寒天プレートから採取した単一のコロニーを3mlのLBブロスに37°Cのシェイキングインキュベーター(振動速度200rpm)で4時間培養します。接種前にLBブロスをバイオフィルム誘導性MSgg培地に置き換え、1.5mlスターター培養液を6,000 x gで4分間遠心分離し、上清液を慎重に除去し、ペレットを1.5 ml MSgg培地に再懸濁します。他の文化は捨てていいのです。重要:システムの堅牢性を確保するために、洗浄されたスターター培養の600nm(外₆₀₀)での光学密度は0.6から1の間ですべきです。
8. スターター培養の過程で、3mlのMSgg培地を含み、12ウェルの細胞培養マルチディッシュプレートを準備します。これは、小分子阻害剤の濃度範囲(例:0.3、0.5、1 mM D-ロイシン)を含みます。エッジ効果を除外するために、異なる濃度の位置をマルチディッシュプレート全体に分散させてください。または、1.5mlのMSgg培地を含む24ウェルの細胞培養マルチディッシュプレートを使用します。
9. 12ウェル細胞培養マルチディッシュプレートのウェルに、洗浄したスターター培養3μl(1:1,000希釈)を接種します。
   注: より低い希釈比、 すなわち1:500の使用も可能です。これによりペリクルの発達時間が短縮されます。
10. ペリクルを23°Cの静的条件下で3日間育てます。この期間中はペリクルを動かさないでください。最終的な表面形態に影響を与える可能性があります。
11. 雷の両眼で均一な露光で写真を撮影しましょう。あるいは、高解像度カメラでペリクルの写真を撮る方法もあります。光の角度や影の不均一によるアーティファクトを避けるために、カメラを三脚に固定してトップダウンで撮影し、両側から45°の柔らかく大きな光源を使いましょう。
    注:B. subtilisの多細胞性を研究する別の方法は、固体のバイオフィルム誘導性MSgg培地を用いたバイオフィルムコロニーアッセイです。ペリクルと同様に、このアッセイは時空間的プロセスの研究を可能にします。小分子阻害剤の有効範囲が判明すれば、バイオフィルムコロニー形成への影響を研究できます。
12. バイオフィルムコロニーを培養するには、未洗浄の前培養物(ステップ1.7)を、乾燥したMSgg 1.5%寒天プレートにテンプレートを用いて対称的に検出します。これは直径8.5cmのペトリ皿につき4滴ずつです。滴がプレートに吸収されるのを待ってから動かしてください。
    注: このテンプレートは、細胞が成長する領域内でバイオフィルムコロニーの均等分布を図るのに役立ちます。テンプレートを作成するには、元のスケールで成長面積全体を描き、等分に分割して中心に印をつけます。直径8.5 cmの円形ペトリ皿の場合、1つのバイオフィルムコロニーに14 cm² が割り当てられます。
13. プレートは30°Cで3日間培養します。この期間中、バイオフィルムコロニーは発達し、三次元のしわのある構造を形成します。
14. ステップ1.11のように写真を撮ってください。

表1。本研究で使用された最終1xのMSgg作文。

1.925 mM	リン酸カリウム一塩基性
3.075 mM	リン酸カリウム二塩基性
100 mM	3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸、pH 7.1
2 mM	塩化マグネシウム六水和物
700 μM	無水塩化カルシウム
50 μMa	六水和鉄(III)塩化物
125 μMb
1 μM	塩化亜鉛 無水
2 μM	チアミン塩酸塩
50 μg/ml	トリプトファン
50 μg/ml	フェニルアラニン
50 μg/ml	スレオニン
0.5% (v/v)	無水グリセロール
0.5% (w/v)	L-グルタミン酸 一ナトリウム塩 水和物
ペリクルアッセイのa;Bはバイオフィルムアッセイ

結果

図1。 バイオフィルム形成の特異的阻害を評価するための堅牢な実験装置の概念的概要。プランクトン成長に顕著な影響を与えず、バイオフィルム形成に特異的な干渉を示す小分子阻害剤の選択基準。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ルリア・ブロス、レノックス	ディフコ	240230
リン酸カリウム一塩基性	シグマ、136.09 g/mol	P0662-500G
リン酸カリウム二塩基性	フィッシャー・サイエンティフィック、174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸	フィッシャー・サイエンティフィック、209.27 g/mol	BP308-500
塩化マグネシウム六水和物	メルク、203.30 g/mol	1.05833.0250
無水塩化カルシウム	J.T.ベイカー、110.98 g/mol	1311-01
マンガン(II)塩化四水和物	シグマ、197.91 g/mol	31422-250G-R
六水和鉄(III)塩化物	シグマ、270.30 g/mo)	F2877-500G
塩化亜鉛 無水	アクロス・オーガニックス、136.29 g/mol	424592500
チアミン塩酸塩	シグマ、337.27 g/mol	T1270-100G
L-トリプトファン	フィッシャー・サイエンティフィック、204.1 g/mol	BP395-100
L-フェニルアラニン	シグマ、165.19 g/mol	P5482-100G
L-スレオニン	シグマ、119.12 g/mol	T8625-100G
無水グリセロール	バイオラボ ITD	712022300
L-グルタミン酸一ナトリウム塩は水和します	シグマ、169.11 g/mol	G1626-1KG
D-ロイシン	シグマ、169.11 g/mol	855448-10G
無水エタノール	ガドット	830000054
シェイカー 37°C	ニューブランズウィック・サイエンティフィック・インノワ42	NA
遠心分離機	エッペンドルフ卓上遠心分離機 5424	NA
インキュベーター 30°C	バインダー	NA
インキュベーター 23 °C	バインダー	NA