バイオフィルムマトリックスの完全性を評価するためのエタノール耐性アッセイ

要約

出典: Bucher, T.ら 。 B. subtilisバイオフィルムを小分子バイオフィルム阻害剤の特性評価モデルとして研究する方法。 J. Vis. Exp. (2016年)。

このビデオは、未処理バイオフィルムと阻害剤破壊されたバイオフィルムにおけるコロニー形成ユニットを比較することで、バイオフィルムマトリックスの完全性が細菌のエタノール耐性にどのように影響するかを示しています。阻害剤処理サンプル中のCFUが低くなっていることは、細胞外マトリックスがバイオフィルム埋め込み細胞を抗菌ストレスから守るために不可欠であることを示しています。

プロトコル

1. エタノール耐性分析

1. バイオフィルムを培養し、30°Cで68時間成長した後、カミソリの刃とテンプレートを使ってバイオフィルムコロニーを等分に分割します。
2. バイオフィルムコロニーの両半分を小さなヘラで寒天プレートから慎重に持ち上げ、500μlのリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を含む1.5mlのマイクロ遠心分離機チューブに移します。必要に応じて、プレートから残りの細胞をこそげ取り、マイクロ遠心分離機チューブに移します。
   注: バイオフィルムコロニーの後半は対照群か滅菌剤耐性の試験かによって異なる処理が行われます。
3. 対照として、バイオフィルムコロニーの後半を500μl PBSで培養します。滅菌剤に対する耐性を評価するために、バイオフィルムコロニーの後半を500μl 50%(v/v)エタノールに移す。
   注: 次亜塩素酸ナトリウムなどの代替滅菌剤も使用可能です。使用されるすべての滅菌剤について、予備実験で有効濃度と培養時間を決定します。
4. バイオフィルムコロニーを室温のベンチトップで10分間孵育させます。
5. バイオフィルムコロニーを18,000 x gで5分間遠心分離し、ピペットで上清液を 慎重に 除去します。PBSを300μl加えます。
6. ソニケーターのマイクロチップで細胞を軽く(振幅10%、パルス5秒)超音波処理します。
   注: 超音波処理エネルギーはバイオフィルム集合体を分離するのに十分なものでなければなりません。しかし、過度に強い超音波検査は細胞を溶解させる可能性があります。事前に光学顕微鏡で超音波検査のエネルギーが細胞を溶除せず、すべての凝集体が溶解していることを確認してください。
7. 最終1mlの体積にPBSを700μl加えます。PBSで連続希釈(^10-7)を行い、無菌ガラスビーズを用いてLB-1.5%寒天プレートに3回の希釈を100μl分散します。
   注: 最適な希釈は予備実験で決定すべきであり、これは対象のバイオフィルムコロニー内の細胞数や滅菌剤に対する細胞の生存率に依存します。
8. プレートを30°Cで一晩培養し、CFUを数えてCFU/mlを測定します。各半分のバイオフィルムコロニーの最終CFU/mlから生存率を計算します。
   注: 前述の方法で実施・解析した場合、対照バイオフィルムコロニーの2つの半分と未処理の半分(未処理・エタノール処理済み)の半分は、生存可能な細胞数で10%未満の差を生み、それぞれ対称性または耐性を検証します。あるいは、結果を総CFUで表すことも可能です。対照群と未処理のバイオフィルムコロニーの細胞数は同じ程度に保たれるべきです。対照的に、小分子処理されたバイオフィルムコロニーのエタノール処理半分の細胞数は、滅菌剤に対する感度向上を主張するために最低でも2桁は減少すると予想されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ルリア・ブロス、レノックス	ディフコ	240230
バクトアガー	ディフコ	214010
リン酸カリウム一塩基性	シグマ、136.09 g/mol	P0662-500G
リン酸カリウム二塩基性	フィッシャー・サイエンティフィック、174.18 g/mol	BP363-1
3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸	フィッシャー・サイエンティフィック、209.27 g/mol	BP308-500
塩化マグネシウム六水和物	メルク、203.30 g/mol	1.05833.0250
無水塩化カルシウム	J.T.ベイカー、110.98 g/mol	1311-01
マンガン(II)塩化四水和物	シグマ、197.91 g/mol	31422-250G-R
六水和鉄(III)塩化物	シグマ、270.30 g/mo)	F2877-500G
塩化亜鉛 無水	アクロス・オーガニックス、136.29 g/mol	424592500
チアミン塩酸塩	シグマ、337.27 g/mol	T1270-100G
L-トリプトファン	フィッシャー・サイエンティフィック、204.1 g/mol	BP395-100
L-フェニルアラニン	シグマ、165.19 g/mol	P5482-100G
L-スレオニン	シグマ、119.12 g/mol	T8625-100G
無水グリセロール	バイオラボ ITD	712022300
L-グルタミン酸一ナトリウム塩は水和します	シグマ、169.11 g/mol	G1626-1KG
D-ロイシン	シグマ、169.11 g/mol	855448-10G
無水エタノール	ガドット	830000054
カミソリの刃	エディソン	NA
円形セルロースフィルターペーパー	ワットマン、90mm	1001-090
グルターアルデヒド	EMS(電子ミコスコピーサイエンス)、水中で25%	16220
パラホルムアルデヒド	EMS、水中16%	15710
カコジル酸ナトリウム	メルク、214.05 g/mol	8.2067
塩化カルシウム2-水和物	メルク、147.02 g/mol	1172113
シェイカー 37°C	ニューブランズウィック・サイエンティフィック・インノワ42	NA
遠心分離機	エッペンドルフ卓上遠心分離機 5424	NA
デジタルソニファイア、モデル250、ダブルステップマイクロチップ使用。	ブランソン	NA
インキュベーター 30°C	バインダー	NA
インキュベーター 23 °C	バインダー	NA
フィルターシステム、500ml、ポリスチレン	コーニグ・インコーポレイテッド	NA
ロータリーシェーカー - オービトロン・ロータトリーII	ブーケル	NA