出典: Bucher, T.ら 、 『B. subtilisバイオフィルムを小分子バイオフィルム阻害剤の特徴付けモデルとして研究する方法論』。 J. Vis. Exp.(2016年)
このビデオは、高解像度イメージングのための成熟細菌バイオフィルムコロニーの準備方法を示しています。固定、脱水、取り付け、そしてバイオフィルム形態の保存と可視化のための金属コーティング工程を扱っています。
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方法論記事
形態学的解析のための細菌バイオフィルムコロニーの準備
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2026年2月26日
この記事について
要約
プロトコル
走査型電子顕微鏡のためのバイオフィルムコロニーサンプル準備
- 細菌バイオフィルムコロニーを育ててください。
- 新たに2%(v/v)グルターアルデヒド、3%(v/v)パラホルマルデヒド溶液を100 mMナトリウムカコジレート、5mM塩化カルシウムバッファー、pH7.3で準備します。直径8.5cmのペトリ皿ごとに5mlの固定剤を準備します。
注意: グルタルアルデヒドとパラホルムアルデヒドは有害です。化学フードの内側で安全装備を装着して扱いましょう。有害廃棄物中の溶液と汚染物質は廃棄してください。 - バイオフィルムの上に直接塗布せず、慎重にバイオフィルムコロニーに加えます。
注: バイオフィルムコロニーの疎水性により、コロニーはゆっくりと寒天から離れて浮かび上がります。 - プレートをパラフィルムのストリップで慎重に密封してください。室温で回転シェイカーで2時間培養し、その後プレートを4°Cに一晩移します。
- 翌日、真空ポンプに接続されたパスツールピペットで慎重に液体を取り出します。
- 慎重に10ml、100mMのカコジル酸ナトリウム、5mMの塩化カルシウム緩衝液を加えてバイオフィルムを洗浄し、5分間培養します。バイオフィルムを傷めないように、パスツールのガラスピペットでプレートの角から液体を優しく取り出し、ピペッティングで新しい洗浄液を加えます。このステップを一度繰り返します。
- バイオフィルムコロニーの脱水については、以下の手順を進めてください:ddH2Oで2回5分ずつ;30%エタノールで20分ずつ2回;50%エタノールで20分ずつ;70%エタノールで20分2回;96%エタノールで20分2回;100%エタノールで30分2回。
- 直径8.5cmのペトリ皿1つにつき15mlの液体を各工程に加え、各孵化後に慎重に液体を取り除きます。
- エタノールからサンプルを乾燥させるには、2つの方法のいずれかを使ってください。
- エタノールからの自然乾燥の場合:
- セルロースフィルターペーパー(直径9cm)を四つに切ります。1/4を100%エタノールに短く浸し、その後慎重に浮遊するバイオフィルムの一つを移します。濡れたろ紙をペトリ皿に入れ、ろ紙で裏打ちします。ペトリ皿を蓋をして、バイオフィルムのコロニーを化学フードで一晩乾かします。
- エタノールからの自然乾燥の場合:
- 電子顕微鏡のスタブにカーボンテープを貼ります。ピンセットを使って、バイオフィルムの群落を慎重にスタブに移します。各コロニーをカーボンテープで薄いブリッジで接続し、電子ビーム下の電荷除去に不可欠です。この段階では、バイオフィルムコロニーは非常に繊細なので慎重に扱ってください。サンプルは乾燥器で少なくとも24時間、または検査まで保管してください。
- 検査当日、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて、金・パラジウムスッタコーターでバイオフィルムコロニーを60°の角度で2分間スパッターコートします。このステップを2回繰り返し、サンプルを120°回転させます。最後に、サンプルに1回スパッターコートを3分間塗ります。20nmの薄い金パラジウム層は導電性を向上させ、走査型電子顕微鏡でのイメージング用にサンプルのコントラストを高めます。
- 試料の再水和を防ぐために、走査型電子顕微鏡によるイメージングを終えるまで、試料を乾燥器に保管します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 無水グリセロール | バイオラボ ITD | 712022300 | |
| 無水エタノール | ガドット | 830000054 | |
| カミソリの刃 | エディソン | NA | |
| 円形セルロースフィルターペーパー | ワットマン、90mm | 1001-090 | |
| グルターアルデヒド | EMS(電子ミコスコピーサイエンス)、水中で25% | 16220 | |
| パラホルムアルデヒド | EMS、水中16% | 15710 | |
| カコジル酸ナトリウム | メルク、214.05 g/mol | 8.2067 | |
| 塩化カルシウム2-水和物 | メルク、147.02 g/mol | 1172113 | |
| スタブアルミマウント | EMS、スロットヘッド | 75230 | |
| カーボン接着テープ | EMS | 77825-12 | |
| シェイカー 37°C | ニューブランズウィック・サイエンティフィック・インノワ42 | NA | |
| インキュベーター 30°C | バインダー | NA | |
| インキュベーター 23 °C | バインダー | NA | |
| ロータリーシェーカー - オービトロン・ロータトリーII | ブーケル | NA | |
| S150スパッターコーター | エドワーズ | NA | |
| 環境走査型電子顕微鏡 | XL30 ESEM FEG フィリップス(FEI) | NA |
