食中毒菌を用いたゼブラフィッシュ幼虫の腸内感染モデル化

要約

出典:Flores, E. ほか。ゼブラフィッシュ幼虫の食中毒の媒介として原生動物のパリミキウム・カウダタムを利用すること。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、蛍光性大腸菌に感染したパラメシアを与えてゼブラフィッシュ幼生に食中毒細菌性腸感染モデルを構築する方法を示しています。

プロトコル

1. ゼブラフィッシュの食中毒
   1. パウロミシアと細菌を培養します。
      1. 感染前夜に Paramecium caudatum と Escherichia coli MG1655の共培養を準備します。E3培地8mL、進行中のパラミシア培養1mL、そして大 腸菌 MG1655培養(OD₆₀₀ = 1.0)1mLをT25組織培養フラスコに1回再懸濁させて組み合わせます。フラスコは室温(RT)で一晩孵化します。各治療条件ごとに、パラミシアのフラスコを2つ用意します。
      2. 菌株(LB(溶原ブロス):1 g/Lトリプトン、0.5 g/L酵母抽出物、1 g/L NaCl)を無菌接種ループでプレートから個別の細菌群を採取して接種します。液体培養液は37°Cで孵化し、毎分110回転(rpm)で一晩振らせます。
         注: 個人用防護具(実験用コートと手袋)を着用し、感染性の取り扱いはバイオセーフティレベル2の施設を使用することが推奨されます。
      3. 翌日、一晩培養の_OD600 を測定します。11mLの培地で再懸濁した場合、OD600の1を達成するために必要な培養量を計算します。
      4. 6,000 x g の遠心分離で細菌の体積を5分間採取し、1フラスコごとに1体ずつ採取します。上清液を捨て、細菌ペレットを1mLのE3培地に再懸濁させます。
      5. オプションとして、蛍光染料で細菌をあらかじめ着色させることもできます。
         1. FM 4-64FXの細菌染色(5 mg/mLのストック溶液)を1 μL加えます。光漂白を防ぐためにチューブをホイルで覆い、室温(RT)で15分間回転させてキュベーションします。
         2. 余分な染料は、6,000 x gで遠心分離して1.5分間E3菌を1回洗浄し、その後1mLのE3培地に再懸濁します。洗う手順を2回繰り返します。
         3. 染色菌は6,000 x gで5分間の染色分離で採取します。上清液を捨て、細菌ペレットを1mLのE3培地に再懸濁させます。
      6. 新鮮なパラミシアのフラスコ2つにそれぞれ1mLの細菌懸濁液を加えます。RTで2時間孵卵します。
         注: 染色された細菌を扱う場合は、RTで暗闇で2時間培養してください
2. 洗浄バクテリア/パロマイチア共培養
   1. 2つのパラミシア/細菌共培養フラスコの内容物を50mLの円錐形チューブにまとめます。遠心分離機は300 x g 、15°Cで10分間サンプルを取る。この工程の前に遠心分離機が予備冷却されていることを確認してください。
   2. 血清学ピペットで約10mLのE3上清液を除去し、約10mLの新鮮な1x E3を円錐形チューブに追加します。
      注: すべての洗浄工程では、上清液を素早く除去することが不可欠です。なぜなら、パリミシアがペレットから泳いで出てしまい始めるからです。この段階で迅速に取り扱い、上清液の損失を防ぐために、一度に1本のチューブから回して除去してください。
   3. 300 x g、15°Cで 遠心分離 して5分間、サンプルをスピンします。血清学ピペットで約10mLのE3上清液を除去し、約10mLの新鮮な1x E3を円錐形チューブに追加します。この手順を2回繰り返してください。
   4. 遠心分離機で300 x g 、15°Cで5分間サンプルを取る。ペレットを乱さないように注意しながら、E3上清液を約10mL除去します。
   5. 残りの10 mLのE3培地にペレットを再懸濁し、500 μLの懸濁液を新しい1.5 mLのマイクロ遠心分離管に移します。500 μLの超人脈を300 x g で遠心分離して5分間ペレットし、その数を数えます。
   6. 500μL試料からE3上清液400μLを除去します。残りの100μLのパラミシアに36.5%ホルムアルデヒド溶液20 μLを加え、優しく再懸浮させて22°Cで5分間培養します。
      注: このステップでパルミシアを殺し、数えることができるようになります。
   7. ピペットを使って実際の総体積を測定し、記録します。パラミシア懸濁液を0.4%のトリパンブルー溶液で1:1 v/vで希釈します。
   8. 細胞計や血液細胞計を使って、死んだパラミシアの数/mLを数えます。
      注: 前の固定ステップのため、ほとんどのパラメシアはこの時点で死んでいますが、この数は共抱卵実験における生きたパレーミシアの数を反映しています。著者らは細菌の共潜伏による有意なパラマイシアの死を発見していないため、ここではこの点を要因として除外できます。
3. パラミシアとゼブラフィッシュの幼虫を共に抱卵させる
   1. 50 mL円錐形チューブ内のパラミシア濃度を計算します
   2. 最終体積3 mLのE3に対して、2 x 10⁵ パラマイシア/mL濃度の洗浄済みパラミシアの体積を計算します。
      注: パロミシアの濃度は、希望する細菌用量に基づいて調整可能であり、これは最適化の対象となります。
   3. ゼブラフィッシュを100 mM Tris pH 8.0にトリカインを加え、最終濃度100 mg/Lで麻酔します。6ウェルプレートの各ウェルに10匹のゼブラフィッシュを移し、適切なトーラミシア濃度を含む新鮮なE33の合計体積に移します。幼虫は受容者の井戸で麻酔から回復するために、最小限の液体で移植されるようにしてください。
   4. 昼間の昼間性インキュベーターで30°Cで2時間孵化し、獲物に最適な照明条件を確保します。
   5. ゼブラフィッシュは、新しいウェルに魚を3mLの新鮮なE3(トリカイン100 mg/L)を含んで少なくとも5回洗浄します。
      注: 洗浄の段階でトリカインを省こうとしないでください。麻酔なしで移動する幼虫を移動させることは、動物への損傷や苦痛のリスクを高めます。
   6. オプションとして、1%低融点アガロース3mLにゼブラフィッシュを黒壁の6ウェルプレートに埋め込むことで、ゼブラフィッシュを画像化準備を行うことも可能です。低溶融アガロースは1xE3で合成され、マイクロ波で加熱されます。溶けたら、トリセインを最終濃度160 mg/mLに加えます。魚を立体顕微鏡下に置き、クリップされたゲルのローディングチップを使い、頭部が左側、尾が右側にあることを確認してください(図1)。アガロースが固まるまで5分間待ち、その後、埋め込まれた魚の上に160 mg/mLのトリカインを含むE3を1枚重ねて画像撮影を行います。

結果

図1:ゼブラフィッシュの細菌による定着。 5 dpfのゼブラフィッシュは感染せずに放置された(A)か、(B)大 腸菌 または(C) サルモネラ腸 球を発現したmCherryで定着しました。野生型(A および B)魚や遺伝子組換え系統(例:Tg(MPO::EGFP)i114は緑色蛍...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Paramecium caudatum、ライブ	カロライナ	131554	いいえ、培養菌は室温以下で保存しないでください
0.4% トリパンブルー溶液	シグマ	T8154-20ML	液体で、無菌ろ過され、細胞培養に適しています。0.81%塩化ナトリウムと0.06%リン酸カリウム、二塩基で調製
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ	276855-100ML	溶剤安全キャビネットに保管してください
大腸菌、MG1655	ATCC	ATCC 700926	他の非病原性大腸菌株に置き換えることができます
FM 4-64FXステイン	サーモ・フィッシャー	F34653	アリコートとストア冷凍
ホルムアルデヒド	シグマ	F8775-4X25ML
LBブロス	シグマ	L3397-1KG
リン酸塩緩衝塩水錠剤	サーモ・フィッシャー	18912014
テトラサイクリン	シグマ	87128-25G	有害で刺激的なもの
トリカイン(エチル3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸)	シグマ	E10521-10G
トライトン X-100	シグマ	X100-100ML
トライパンブルー溶液、0.4%	シグマ	93595-50ML
ウルトラピオリ低融点アガロース	サーモ・フィッシャー	16520050
ヘモサイトメーターまたは細胞計	どんなものでも
立体顕微鏡	どんなものでも
卓上遠心分離機
マイクロ波
回転車輪
加熱振動インキュベーター
水泳施設
繁殖用水槽