電気化学反応器を用いた細菌単分子層バイオフィルムの発生

要約

出典:Tokunou, Y. ら、『Shewanella oneidensis MR-1における細胞外電子輸送における重水素の動態同位体効果の電気化学的検出』。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、電極表面のバイオフィルム形成をシミュレートするために設計された電気化学反応器モデルの組み立てと動作を示しています。制御された電気化学的刺激は微生物の接着を促進し、細菌単層バイオフィルムの徐々の発生につながります。

プロトコル

1. 3電極電気化学反応器の構築 (図1)
   1. 原子炉底部にインジウムスズドープ酸化物(ITO)基板を作動電極として配置します。
   2. 次に、直径2cmのガラスシリンダーとポリテトラフルオロエチレン(PTFE)カバーを挿入します。次に、銀/塩化銀(Ag/AgCl)(塩化カリウム、KCl飽和)とプラチナ線をそれぞれ基準電極とカウンター電極として原子炉に挿入します。
      注: 空気や溶液の漏れを防ぐために、各成分の間にブチルゴムシートを挿入します。
   3. 10 mM乳酸塩と0.5 g/L酵母抽出物を補足した定義培地(DM)4.0 mLを電気化学反応器に加えます。
   4. 電気化学反応炉からの漏れがないことを確認すると、窒素ガスを20分間電気化学反応器に流し、反応器内の嫌気性状態を維持します。
      注: 他の微生物との汚染を防ぐため、ガスは電気化学反応器に入る前にろ過されるべきです。
   5. 電気化学反応器をポテンシオスタットに接続し、標準水素電極(SHE)に対して+0.4VをITO電極に加圧し、外部水循環システムを用いて電気化学反応器の温度を30°Cに保ちます。
      注: 外部電場の影響を防ぐために、電気化学反応器はファラデーケージ内に設置されるべきです。
2. S. oneidensis MR-1細胞の電気化学的培養 (図1および図2)
   1. ステップ1.1で得られた懸濁液の細胞密度を600nm(_OD600)で1.43の光学密度に調整し、DMに10 mM乳酸塩と0.5 g/L酵母抽出物を補います。
      注: 正しいOD₆₀₀を得るには、OD₆₀₀ ≤0.8のセル懸濁液をUV-visc分光計に適用し、その後OD₆₀₀ を1.43に調整します。
   2. 注射器を使って注入ポートを通じて0.3mLの細胞懸濁液を電気化学反応器に加えると、反応器内のOD₆₀₀ は0.1に変化します。
      注: OD₆₀₀ = 1.43の0.3 mL細胞懸濁液を4.0 mLの電気化学反応器に添加すると、OD₆₀₀ = 0.1の溶液4.3 mLが得られます。体積の異なる他の原子炉を使用する場合は、セル密度の計算が必要です。
   3. +0.4 V(SHEに対して)でITO電極への電位印加を25時間続けます。
      注: ITO電極上の単分子層バイオフィルム形成には、生成される電流が 図2から50%未満の偏差を示すことを確認してください。

結果

図1:本研究で使用される電気化学反応器。 建設前(a)および建設後の電気化学セルの写真(b)。(c) +0.4 Vで25時間の電気化学接種後の電気化学反応器の回路図 vs SH

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガラスシリンダー	該当なし	該当なし	特注品で電気化学反応器として使用されます
PTFEカバーとベース	該当なし	該当なし	特注で、電気化学反応器のカバーおよび基礎として使用されます
ブチルゴム	該当なし	該当なし	特注で、電気化学反応器の各部品の間に挿入されます
セプタ	GLサイエンス	3007-16101	電気化学反応器の注入ポートとして使用
インジウムスズドープ酸化物(ITO)電極	ジオマテック	No.0001	作動電極として使用、5Ω/sq
Ag/AgCl KCl 飽和電極	北斗電工	HX-R5	基準電極として使用、Φ0.30mm
プラチナ線	ニラコ・コーポレーション	PT-351325	カウンター電極として使用
ルリア・ベルターニ(LB)ブロス、ミラー	ベクトン・ディクキンソン・アンド・カンパニー	244620	S. oneidensis MR-1の前培養培地
バクト寒天	ベクトン・ディクキンソン・アンド・カンパニー	214010
NaHCO₃	和子	191-01305	定義媒体(DM)に使用されます
CaCl₂·2H₂O	和子	031-00435	DM用に使用
NH₄Cl	和子	011-03015	DM用に使用
MgCl₂·6H₂O	和子	135-00165	DM用に使用
NaCl	和子	191-01665	DM用に使用
2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)	ドジンド	346-08235	DM用に使用
乳酸ナトリウム溶液	和子	195-02305
バクト酵母抽出物	ベクトン・ディクキンソン・アンド・カンパニー	212750
重水素酸化物(D、99.9%)	ケンブリッジ同位体研究所株式会社	DLM-4-PK	動力同位体効果実験のための加法
インキュベーター	東京理カキ会株式会社	LTI-601SD	事前栽培に使用
シェイカー	タイテック	NR-3	事前栽培に使用
オートクレーブ機	東美精工株式会社	LSX-500	電気化学反応器および媒体の滅菌に使用されます
きれいなベンチ	三洋	MCV-91BNF	電気化学反応器および媒体の他の微生物による汚染を防ぐために使用されます
遠心分離機	エッペンドルフ	5430R	回転速度は最大6000×gが必要です
窒素ガス発生装置	プエク社	PNTN-2	窒素ガスシリンダーはガス発生装置の代わりに使われることもあります
UV-vis分光計	島津	UV-1800	セル密度の最適化に使用
ポテンシスタット	バイオロジック	VMP3	バイオフィルム形成および動力同位体効果実験に使用
温泉水循環装置	一つに	TR-1A	電気化学反応器の温度維持に使用
ファラデーケージ	北斗電工	HS-201S	電気化学実験に使用