GFPタグ付けSKN-1を用いた C. elegans における病原体誘発性酸化ストレスの可視化

要約

出典:Naji, A., 他カエノラブディティス・エレガンスにおけるミティス群連鎖球菌による酸化ストレスの研究。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、C. elegansにおける緑色蛍光色タンパク質標識SKN-1を用いて、緑色蛍光を追跡することで酸化ストレスを監視する方法を示しています。 S. gordonii に曝露されたミミズは強い核蛍光を示し、病原体誘発ストレスを裏付ける一方、大 腸菌 を与えられたミミズは細胞質内に拡散した緑色蛍光を示し、SKN-1活性化が最小限であることを示しています。

プロトコル

1. ストレプトコッカス・ゴルドニイ感染に対するSKN-1の局在観察

1. ストレプトコッカスをまくTodd–Hewitt酵母エキス(THY)と、大腸菌(E. coli)を授かれた線虫培養培地(NGM)各寒天プレートに約100個のL4幼虫を加えます。細菌株ごとに3枚のプレートを使いましょう。プレートを25°Cで2〜3時間孵化します。
2. その後、培養皿をインキュベーターから取り出し、改造されたM9バッファー(M9W)で洗浄し、15mLの円錐形チューブにミミズを採取します。
3. ミミズは3回洗ってください。
4. 吸引でM9Wの大部分を除去し、2 mMアジドナトリウムまたは2 mMテトラミソール塩酸を含む500 μLのM9Wをミミズペレットに加えます。これにより、顕微鏡で画像化しても虫が動かないように麻酔されます。
   注意:アジドウムを扱う際は個人用防護具(PPE)を着用してください。化学フードの下でアジド溶液を準備します。
5. ミミズペレットは室温(RT)で15分間抱卵します。次に、15μLのミミズ懸濁液を準備されたアガロースパッドに塗布します。麻酔された虫が入ったアガロースパッドの上にNo.1.5のカバースリップを優しく置きます。
6. 蛍光顕微鏡を用いて、フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)と4′,6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)フィルターを用いて、スキンヘッドファミリー転写因子1、すなわちSKN-1:GFP(緑色蛍光タンパク質標識SKN-1)の局在を可視化します。10倍と20倍の倍率で画像ワームが発生します。
7. SKN-1の局在レベルに基づいてミミズの評価をつけてください。線虫の前方または後方における核局在、SKN-1B/C::GFP(緑色蛍光タンパク質標識SKN-1アイソフォームB/C)の局在、およびすべての腸内細胞におけるSKN-1B/C::GFPの核局在は、それぞれ低、中、高の局在レベルに分類されます。
8. 蛍光顕微鏡のスコアリング後、統計ソフトウェアを用いてカイ二乗検定とフィッシャーの正確検定で統計的差異を算出します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
メディアと化学物質
BDバクト・トッド・ヒューイットのブロス	フィッシャー・サイエンティフィック	DF0492-17-6
15 mL円錐形の無菌ポリプロピレン遠心分離機管	フィッシャー・サイエンティフィック	12-565-269
アジ化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S2002-25G
テトラミソール塩酸塩	シグマ・オルドリッチ	L9756
No.1.5 18 mm x 18 mm カバースリップ	フィッシャー・サイエンティフィック	12-541A
アガロース	シグマ・オルドリッチ	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + ROL-6(su1006)	キース・ブラックウェル