細菌性肺感染症の確立のためのマウス口咽頭吸引モデルの準備

要約

出典: Nielsen, T. B. ら、 人工呼吸器関連および院内獲得性細菌性肺炎のマウス口咽頭吸引モデル。 J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、麻酔を受けたマウスの口咽頭から細菌を肺に届け、肺感染症を誘発し免疫反応を引き起こす手順を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウスへの接種/感染

1. 麻酔をかけたマウスを、上切歯で強く細い紐(例:デンタルフロス)に吊るし、マウスの体長の約2倍(例:実験台)から固定された物体に固定します。
2. 滅菌された鈍い鉗子を使って、ネズミの舌を優しく口から引き抜きます。舌を滅菌された手袋をした指に移し、誤って舌を潰すのを防ぎます。舌を口の外に出して口咽頭にアクセスさせ、接種物を横から飲み込むのを防ぎます。
3. マウスの舌を握ったまま、マイクロピペットを使って50μLの接種液(細菌懸濁液)を口咽頭に挿入します。口咽頭は口腔と咽頭の接合部、口の奥に位置しています。
   注: 液体はピペットでマイクロピペットの最初のストップのみに供給することが非常に重要です。接種装置が口咽頭に挿入されると、マウスは数秒間呼吸を停止します。最終的に、反射的誤嚥によってマウスは細菌の懸濁液を吸い込み、肺に液体が入る際の特徴的なパチパチという音が現れ、肺炎感染を引き起こします。
4. 接種点が正常な呼吸を遮るほど後ろに置かれていない場合は、鉗子で鼻腔をつまんで反射吸引を口から強制し、その後に接種点を吸い込む。
5. 接種後は舌を解放し、ネズミを懸浮糸から外し、ケージに入れて麻酔から目覚めるまで監視します。

2. 疾患進行のモニタリング

注: 動物の苦しみのため、マウスが死に至ったことを示すために様々な指標を用いるべきです。この決定の後、事前に承認されたIACUCプロトコルに従って安楽死を行うべきです。死の指標には、体温、体重減少、外見、歩行、そして血液から得られるその他のバイオマーカー(例: iSTAT)などがあります。

1. マウスは以前に承認されたIACUCプロトコル(例:_CO2投与後に子宮頸部脱臼)に従って安楽死させてください。
2. 安楽死したマウスの肺は、気管、肺動脈、肺静脈を肺の近くで切断して摘出します。
   1. 顕微鏡
      1. 肺(または一部)を標本型に入れます。
      2. 最適な切断温度(O.C.T.)化合物を標本型に充填し、組織を完全に浸します。
      3. サンプルを-80°Cで凍結します。
      4. サンプルを病理検査室に送り、切片してスライドにマウントして顕微鏡検査を行います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔室	ケント・サイエンティフィック・コーポレーション	VetFlo-0720	最大5匹のマウスを収容可能です
クライオモールド、中間サイズ	サクラ・ティッシュテック	4566	使い捨てビニール試料型、15×15×5 mm
デンタルフロス	オーラルBクラス	37000469537	テーブルの高さから約6インチの高さに馬小屋の柱に結びつけます
鉗子	VWR	82027-440	マウスの口から優しく舌を引き抜くために使われていました
麻酔用のイソフルラン	アボット	10015516	代替薬物の使用も可能です。手順を適切に修正してください
iSTATカートリッジ	アボット	03P79-25	さまざまなカートリッジがご用意されています。
ケタミン、100 mg/mL	ウェスタン・メディカル・サプライ	4165	PBSで1:10を希釈して1 mg/mLにし、キシラジンと1 mg/mLで混合します
眼用軟膏	アコーン	涙が再び流れる	ディスペンサーの先端で目を触らないようにしてください
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	コーニング	21-031-CM	カルシウムとマグネシウムなしのダルベッコPBS
ピペットチップ、200 μL	VWR	10017-044	使用前のオートクレーブ
ピペッター、200 μL	ギルソン	ピペットマン P200	使用前にオートクレーブと校正を行ってください
スプレッダー、細菌細胞	ベルアート	F377360006	使用前に焼き付けるかオートクレーブで滅菌してください
バイアル、低温用、2.0 mL	コーニング	430659	濃縮細菌接種点の極低温保存に使用